利用TILLING技术筛选油菜根毛突变体及根毛发生发育相关基因的分离

摘要

甘蓝型油菜是重要的油料作物，缺磷导致油菜产量降低、品质下降。通过分子生物学实验技术从分子水平上揭示油菜对磷吸收、利用、分配的特性，能够为油菜的磷营养机理研究及其性状改良提供基础。本研究以实验室构建的宁油7号EMS突变体库为材料，根据拟南芥的基因信息，利用同源序列法和PCR－walking技术分离油菜中控制根毛发生发育的相关基因BnWER、Bn-AT5G49270和BnCPC。然后，根据序列分析确定的BnWER的两个同源基因的差异设计基因特异引物，利用TILLING（靶向筛选基因组局部点突变）技术筛选上述突变体库得到了根毛突变体，并鉴定了根毛突变体与磷营养的关系。
　　 获得的主要结果如下：
　　 1．甘蓝型油菜中BnWER，Bn-AT5G49270，BnCPC同源基因的分离。
　　 利用同源序列法和PCR-walking的方法在油菜中分离到与控制拟南芥根毛发生发育的转录因子WER同源的两个全长基因，分别命名为BnWER－1和BnWER-2，其同源性为98％。BnWER-1与BnWER-2的差异在于：与BnWER-2相比，BnWER－1的第二个内含子1355th bp处有26 bp（AGGGCCTGACTATATACTAGTTGTCT）片段的缺失。利用相同的方法分离得到控制拟南芥根毛发生发育的基因．AT5G49270在油菜中的同源基因，与拟南芥中该基因的同源性为86％。通过序列分析分离得到Bn-AT5G49270的两个同源基因片段，其中一个同源基因片段有9 bp（CTGTATATA）的缺失。在油菜中分离得到控制拟南芥根毛发生发育的转录因子CPC的基因片段682 bp，与拟南芥中该基因的同源性为85％～93％。
　　 2．BnWER突变体的筛选。
　　 根据BnWER两个同源基因之间的差异设计了两对TILLIANG引物，分别为BnWER-1F/1R，BnWER-2F/2R。用这两对引物筛选宁油7号EMS突变体库2980个M2单株，共检测到16个突变位点。对16个突变位点对应的突变单株PCR产物进行测序，发现14个突变位点由G/C突变成了A/T，有2个突变位点是T突变成G。16个突变位点中有7个位于基因的内含子位置，在翻译的过程中被剪切，预测其对基因的功能没有影响。位于外显子的突变位点有9个，用PARSESNP程序预测表明，点突变对基因编码氨基酸有影响。
　　 3．突变体表型的鉴定及评价突变体与磷吸收利用的关系。
　　 营养液培养试验表明，与野生型相比，突变体M273、M024、K413根毛数量和长度没有明显的增加，而且，突变体M273、M024、K413对提高磷吸收利用效率的优势都没有体现出来。
　　 4．BnWER-1与BnWER-2的表达分析及基因定位。
　　 检测BnWER-1在两种磷处理下野生型和突变体中的表达丰度没有差异。BnWER-1在亲本和群体中均没有多态性，而BnWER-2在亲本中有多态性而在群体中没有多态性。因此基因的表达及定位分析均未得到理想的结果，需要重新设计引物进行基因表达和定位分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

1.文献综述

1.1植物响应低磷胁迫的适应性机理

1.1.1低磷胁迫时植物根系形态构型变化

1.1.2低磷胁迫时植物生理适应机制

1.1.3油菜磷高效机制

1.2植物根毛的发生发育及其相关基因

1.2.1控制植物根毛分化形成的基因

1.2.2与植物根毛发生相关的MYB类转录因子

1.3 TILLING技术在作物遗传改良中的研究进展

1.3.1 TILLING技术的原理及技术路线

1.3.2 TILLING引物的设计与点突变的检测

1.3.3 TILLING技术中突变体表型的鉴定

1.3.4 TILLING技术的特点与其在作物遗传改良中的应用

2.研究意义和目的

2.1研究意义

2.2研究基础

2.3研究目的

2.4研究内容

2.5技术路线

3.甘蓝型油菜BnWER，Bn-AT5G49270，BnCPC同源基因的分离

3.1材料与方法

3.1.1试验材料与基因信息来源

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1 BnWER两个全长同源基因的分离

3.2.2 Bn-AT5G4927D基因的分离

3.2.3 BnCPC基因的分离

3.3讨论

4..BnWER突变体的筛选

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2试验方法

4.2结果与分析

4.2.1 BnWER荧光引物预检测及合成的结果分析

4.2.2 BnWER突变位点的筛选结果

4.2.3碱基改变对基因功能的影响

4.3讨论

5.突变体表型的鉴定及与磷吸收利用的关系

5.1材料与方法

5.1.1试验材料

5.1.2试验方法

5.2结果与分析

5.2.1野生型和突变体根毛数量的差异

5.2.2野生型和突变体磷吸收利用效率差异分析

5.3讨论

6.BnWER-1与BnWER-2的表达分析及基因定位

6.1材料与方法

6.1.1试验材料

6.1.2试验方法

6.2结果与分析

6.2.1 BnWER-1的表达分析

6.2.2TN群体及亲本中BnWER基因的多态性

6.3讨论

7.结论与展望

7.1结论

7.2下一步工作及展望

参考文献

致谢

附录