成团泛菌A021的β-甘露聚糖酶基因的克隆、表达、蛋白纯化和酶学性质研究

摘要

β-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase，E.C3.2.1.78)是能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖主链的一类酶，属于半纤维素酶类，广泛存在于自然界的微生物、植物、低等动物中。该酶用途广泛，能分解魔芋葡甘露聚糖，产生能促进双歧杆菌生长、改善肠道菌群结构的魔芋低聚糖；可作为工具酶用于天然多糖类结构的分析；在造纸工业中，与β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，能除去纸浆中的半纤维素，改善纸质；在纺织工业中用于纤维中半纤维素的降解，能有效去除纺织品所粘附的多余染料；在饲料工业中用作酶添加剂，能起到消除抗营养因子的作用。β-甘露聚糖酶的应用前景广阔。但目前总的来说,低产量和高成本限制了其应用范围和规模。能改变这种状况的最重要的途径之一是筛选和培育β-甘露聚糖酶的高产菌株。
　　本研究从一批分离自福建省厦门市浅海泥样的菌株中筛选到一株具有较高β-甘露聚糖酶活性的菌株，经16S rDNA鉴定为成团泛菌。通过建立该菌株的基因组文库，克隆得到一个尚未报道的甘露聚糖酶基因man26P，并进行异源表达。利用GST标签，采用亲和层析法纯化该基因的产物Man26P，并对其一系列酶学性质进行了测定。
　　用刚果红染色法从以甘露聚糖为唯一碳源的固体培养基上筛选得到一株能够产生水解圈的菌株，编号为A021。PCR扩增菌株A021的16S rDNA并送交北京三博远志生物技术有限公司测序。多序列比对结果显示， A021与成团泛菌 Pantoea agglomerans的同源性最高，达99%。由于成团泛菌的甘露聚糖酶活性尚无报道，因此对Pantoea agglomerans A021进行基因组文库的构建。采用刚果红染色法选择出具有甘露聚糖酶活性的重组子。该重组子即插入了含有目的基因的片段。测序结果显示，目的基因（man26P）是一个新基因，完整的ORF长度为1047 bp，其编码的多肽（Man26P）由348个氨基酸组成，与胡萝卜软腐果胶杆菌产生的甘露聚糖酶有最高同源性（63%），属于糖苷水解酶第26家族。将扩增的 man26P酶切后连接表达载体pGEX-6P-1，转化大肠杆菌BL21（DE3），以终浓度0.15 mmol/L的IPTG18 oC诱导表达，得到高浓度的重组蛋白。亲和层析法去掉GST标签，对纯化的Man26P进行酶学分析，得到一系列数据：蛋白浓度0.226 mg/mL，最适反应pH6.0，最适温度55 oC，pH耐受范围4.0-10.0，60oC以下保持稳定，酶活力514U/mg，Km=6.33 mg/mL, Vmax=1110.526μmol/min?mg，kcat=42755.25/min，金属离子Zn2+, Mg2+和Co2+促进酶活，Mn2+，Cu2+和Hg+强烈抑制酶活，1%的β-巯基乙醇使酶活增加了一倍,而1%的SDS强烈的抑制酶活。该酶底物特异性强，专一性水解甘露聚糖，无其他半纤维素酶活性，在含盐环境下酶反应活性更强。总体说来，Man26P是一个易表达纯化、稳定性好、活性高、底物专一性强、耐盐的甘露聚糖酶。这些性质决定了它的应用潜力。

目录

声明

缩略语表

1.前言

1.1研究问题的由来

1.2 研究背景

1.2.1 甘露聚糖

1.2.2 甘露聚糖酶

1.2.3 成团泛菌

1.2.4 国内外研究现状

1.3 研究目的与意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 试剂

2.1.4 培养基

2.1.5仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1甘露聚糖酶产生菌的筛选

2.2.2 细菌基因组DNA的提取

2.2.3 细菌16S rDNA扩增及分子鉴定

2.2.4海洋细菌基因组文库的构建

2.2.5 生物信息学分析插入片段

2.2.6甘露聚糖酶基因的克隆

2.2.7甘露聚糖酶的表达与纯化

2.2.8甘露聚糖酶酶学性质研究

3.结果与分析

3.1 高产甘露聚糖酶海洋细菌的筛选

3.2 Pantoea agglomerans A021基因组文库的构建

3.2.1载体的制备

3.2.2 Pantoea agglomerans A021基因组DNA部分酶切

3.2.3 文库的验证

3.2.4 文库的筛选

3.2.5 生物信息学分析插入片段

3.3甘露聚糖酶（Man26P）的研究

3.3.1甘露聚糖酶基因（man26P）克隆

3.3.2 甘露聚糖酶Man26P的表达与纯化

3.3.3 甘露聚糖酶Man26P酶学性质研究

4.小结和讨论

4.1小结

4.2 讨论

参考文献

致谢

附录1

附录2

附录3