大豆异黄酮与玉米赤霉烯酮对乳腺癌细胞系MCF-7联合作用的研究

摘要

玉米赤霉烯酮(zearealenone,ZEA)是我国饲料中污染比较严重的一种霉菌毒素,具有雌激素活性,对动物的繁殖性能构成巨大的危害。大豆异黄酮(soybeanisoflavone,SIF)主要存在于豆科植物的荚豆类,以大豆中含量较高,也具有轻度雌激素作用,能够与动物雌激素受体结合,当体内雌激素水平较低时可以表现出雌激素活性而当异黄酮浓度较高时则表现为抗雌激素活性,具有双向调节平衡功能。富含大豆异黄酮的豆粕等大豆制品是重要的蛋白质补充饲料,而玉米赤霉烯酮在配合饲料中污染十分普遍,因此,ZEA与GEN在配合饲料中常常共存,存在着对动物的联合作用。本课题以雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象,研究ZEA和GEN联合作用对MCF-7细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响,并揭示其作用的可能机制。
　　 将ZEA、GEN和E2用无水乙醇溶解,用无酚红DMEM(含5％CDT-FBS)培养液稀释到所需浓度。试验共分10个组,分别为:(1)溶剂对照组；(2)阳性对照组:8nmol/LE2；(3)处理1:10nmol/L ZEA；(4)处理2:20nmol/LZEA；(5)处理3:16μmol/LGEN;(6)处理4:32μmol/LGEN;(7)处理5:10nmol/LZEA+16μmol/LGEN；(8)处理6:10nmol/LZEA+32μmol/LGEN；(9)处理7:20nmol/LZEA+16μmol/LGEN；(10)处理8:20nmol/LZEA+32μmol/LGEN。通过流式细胞仪在448nm波长下进行细胞DNA含量和细胞周期分布百分比分析；MTT比色试验,观察各处理对细胞增殖的影响；采用RT-PCR和Western印迹法定量检测细胞周期蛋白E1(CyclinE1)、细胞周期蛋白激酶2(CDK2)、死亡抑制基因(bcl-2)与死亡诱发基因(bax)mRNA表达及蛋白质表达丰度,采用RT-PCR检测雌激素受体(estrogen receptor,ER)mRNA表达丰度,并通过Giemsa染色法检测细胞形态判定各处理对细胞凋亡的影响。
　　 试验结果:
　　 1.对细胞增殖的影响:同溶剂对照组相比,ZEA在较低浓度条件下(10nmol/L,72h)就能促进MCF－7细胞增殖(p<0.05),32μmol/L GEN对MCF-7细胞处理24h可明显抑制MCF－7细胞增殖(p<0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8中,16μmol/L、32μmol/L GEN可显著降低10nmol/L、20nmol/LZEA处理24h、48h、72h引起的MCF－7细胞增殖(p<0.05)。
　　 2.对细胞周期的影响:同溶剂对照组相比,处理3、处理4 S期细胞比例显著减少(p<0.05),阳性对照组、处理1、处理2显著增加了MCF－7细胞S期的分布(p<0.05)。同溶剂对照组相比,处理5、处理6、处理7、处理8中,16μmol/L、32μmol/L GEN可显著降低10nmol/L、20nmol/L ZEA引起的S期细胞比例增加(p<0.05),同时显著的增加了G2/M期的细胞比例(p<0.05)。
　　 3.对ERα、ERβ mRNA表达影响:同溶剂对照组相比,阳性对照组,处理2显著的上调了MCF-7细胞ERα、ERβ mRNA表达丰度(p<0.05),处理4显著下调了MCF-7细胞ERa、ERβ mRNA表达丰度(p<0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8显著下调了MCF一7细胞ERa、ER[3 mRNA表达丰度(p<0.05)。
　　 4.对bcl-2、bax mRNA及蛋白质表达影响:同溶剂对照组相比,阳性对照组和处理1、处理2均可明显上调bcl-2,下调bax的mRNA和蛋白质的表达(P<0.05),但是,处理4、处理5却明显下调bcl-2,上调bax的mRNA和蛋白质的表达(p<0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8显著下调了bcl-2,同时上调了bax mRNA和蛋白质的表达(p<0.05)。
　　 5.对CDK2、CyclinE1 mRNA及蛋白质表达影响:同溶剂对照组相比,处理1、处理2可明显上调CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白质的表达(p<0.05),但是,处理3、处理4明显下调CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白质的表达(p<0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8显著下调了CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白质的表达(p<0.05)。
　　 6.对细胞凋亡的影响:Giemsa染色显示溶剂对照组、处理3、处理4、处理5、处理6、处理7、处理8,能够抑制MCF-7细胞生长,促使其凋亡,而阳性对照组、处理1、处理2中MCF-7细胞则未见有深染的凋亡细胞。
　　 结论:
　　 1.16μmol/L、32μmol/L的GEN能够抑制10nmol/L、20nmol/L ZEA诱导的MCF-7细胞增殖。
　　 2.16μmol/L、32μmol/L的GEN能够下调MCF-7细胞bcl-2、CyclinE1以及CDK2mRNA及蛋白质表达,同时上调bax mRNA和蛋白质的表达。
　　 3.32μmol/L的GEN降低了10nmol/L、20nmol/L ZEA雌激素方面的活性,这种作用可能是通过下调ERα、ERβ mRNA表达而实现的。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一部分 文献综述

1 前言

2 国内外研究进展

2.1 玉米赤霉烯酮的污染状况

2.2 玉米赤霉烯酮的代谢

2.3 玉米赤霉烯酮的毒性

2.4 大豆异黄酮的基本性质

2.5 大豆异黄酮的代谢转化

2.6 大豆异黄酮的生物学功能

2.7 大豆异黄酮的应用

2.8 大豆异黄酮与玉米赤霉烯酮的联合作用

3 研究的目的意义

第二部分 材料与方法

1 试验材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂配制方法

2 试验方法

2.1 试验分组

2.2 细胞预处理

2.3 MTT试验

2.4 MCF-7细胞周期分布的测定

2.5 ERα、ERβ、bax、bcl-2以及cdk-2、CyclinEl mRNA表达丰度测定

2.6 bax、bcl-2及CDK2、CyclinEl蛋白质表达丰度测足

2.7 细胞Giemsa染色及形态观察

5 统计学处理

第三部分 结果与分析

1 ZEA、GEN对MCF-7细胞增殖影响

2 ZEA、GEN对MCF-7细胞周期分布及增殖指数的影响

3 ZEA、GEN对MCF-7细胞ERA和ERa MRNA表达的影响

4 ZEA、GEN对MCF-7细胞BCL-2和BAX MRNA表达的影响

5 ZEA、GEN对MCF-7细胞对CDK2和CYCLINEl MRNA表达的影响

6 ZEA、GEN对MCF-7细胞BAX、BCL-2蛋白质表达的影响

7 ZEA、GEN对MCF-7细胞CDK2、CYCLINEl蛋白质表达的影响

8 ZEA、GEN对MCF-7细胞凋亡的影响

第四部分 讨论

1.ZEA、GEN对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响

2 ZEA、GEN对MCF-7细胞增殖、凋亡影响的可能机制

3 ZEA和GEN雌激素活性方面联合作用的类型

4 ZEA和GEN雌激素活性方面联合作用的可能机制

第五部分 小结

1 结论

2 创新点

3 问题与展望

参考文献

致谢