一株根际芽孢杆菌HNA3拮抗植物病原真菌的研究

摘要

本实验室从植物根际土壤中分离获得的细菌HNA3具有广谱抗真菌能力，能够体外拮抗所有供试植物病原真菌。通过对LB平板上HNA3的形态观察，发现其菌落后期圆形、干燥、褶皱，但在PSA平板上难形成单菌落；染色镜检观察到HNA3菌体呈杆状、成对或链状排列，可形成椭圆形内生芽孢。其16S rDNA序列同源性分析显示其与解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌具有极高的同源性（均达99%），进一步通过相关功能基因tetB-tetL上下游基因排列顺序的不同，鉴定HNA3为解淀粉芽孢杆菌。
　　初步优化了HNA3的摇瓶发酵条件，结果显示BPY(牛肉膏蛋白胨酵母粉)培养基适合HNA3的生长和产生抗真菌活性物质，此活性物质存在于发酵除菌液中，培养基pH值在5.0-9.0之间都适合其菌体生长和产生抗真菌活性物质，摇瓶培养48h后HNA3菌体量和抑菌能力均达到最大且趋于稳定。
　　探讨了HNA3发酵所产抗真菌活性物质的稳定性，发现HNA3生产抗真菌活性物质的能力具有遗传稳定性，该抗真菌活性物质对热、紫外线有较高的稳定性，对pH值、有机溶剂、不同浓度的供试金属离子和非金属离子具有不同程度的耐受性，可作为其实际应用的参考条件；蛋白酶K对其活性无影响可推断该抗真菌物质不是蛋白类成分；发酵除菌液调至pH5.0时出现具有抗真菌活性的沉淀，加入30%的硫酸铵时活性物质沉淀出来，这两种处理可作为该抗真菌物质的分离方法。酸沉淀法分离获得的HNA3抗真菌物质，经甲醇溶解后，可通过高效液相色谱分离纯化。
　　分析了HNA3发酵所产抗真菌活性物质是否具有表面活性剂特性，显示HNA3发酵除菌液及酸沉淀的再溶解液均显示出液滴坍塌和排油能力，表明该抗真菌物质可能是脂肽类成分。三类脂肽合成的相关功能基因 PCR和序列分析，发现 HNA3基因组上存在Iturin合成相关基因。
　　HNA3发酵除菌液能够抑制植物病原真菌菌丝的生长，还具有抑制真菌孢子萌发的能力。盆栽实验初步观察到HNA3发酵液对玉米小斑病具有一定的生防作用。

目录

声明

1 前言

1.1 PGPR

1.1.1 什么是PGPR

1.1.2 PGPR的种类

1.1.3 PGPR的作用机制

1.1.4 PGPR的应用方法

1.2 芽孢杆菌生产的抗菌物质

1.2.1 核糖体合成途径

1.2.2 非核糖体合成途径

1.3 PGPR应用展望

1.4 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和材料

2.1.2 培养基

2.1.3 缓冲液

2.1.4 分子生物学试剂

2.1.5 仪器设备及软件

2.1.6 生化试剂

2.2 方法

2.2.1 抑菌谱的测定

2.2.2 光镜观察细菌及真菌

2.2.3 细菌总DNA提取及有关基因序列分析

2.2.4 发酵条件的初步优化

2.2.5 抗真菌活性物质的稳定性分析

2.2.6 表面活性剂特性分析

2.2.7 抗真菌活性物质的分离纯化

2.2.8 防治玉米小斑病原菌实验

3 结果与分析

3.1 HNA3的抑菌谱

3.2 HNA3的鉴定

3.2.1 形态观察

3.2.2 16S rDNA序列分析

3.2.3 部分功能基因排列分析

3.3 HNA3发酵条件的初步优化

3.3.1 培养基优化

3.3.2 pH值优化

3.3.3 培养时间优化

3.4 HNA3发酵所产抗真菌物质稳定性研究

3.4.1 传代对抗真菌物质活性的影响

3.4.2 温度对抗真菌物质活性的影响

3.4.3 蛋白酶K对抗真菌物质活性的影响

3.4.4 紫外线照射对抗真菌物质活性的影响

3.4.5 pH值对抗真菌物质活性的影响

3.4.6 有机溶剂对抗真菌物质活性的影响

3.4.7 非金属离子对抗真菌物质活性的影响

3.4.8 金属离子对抗真菌物质活性的影响

3.4.9 (NH4)2SO4处理发酵除菌液

3.5 HNA3发酵所产抗真菌物质表面活性剂特性分析

3.5.1 液滴坍塌实验结果

3.5.2 排油实验结果

3.6 HNA3拮抗真菌功能基因序列分析

3.7 HNA3发酵所产抗真菌物质的分离纯化

3.8 HNA3抑制玉米小斑病原菌的研究

3.8.1 抗真菌物质对玉米小斑病原菌生长的影响

3.8.2 抗真菌物质对玉米小斑病原菌孢子萌发的影响

3.8.3 发酵液对玉米小斑病的防治效果初步观察

4 小结与讨论

参考文献

致谢

发表论文

附录