非洲鸵鸟胫骨的形态学特征及硼对其生长发育的影响

摘要

非洲鸵鸟(Struthio camelus)是世界上现存体形最大的鸟,现已列为世界濒危动物范畴。非洲鸵鸟原产于非洲草原和阿拉伯沙漠,属于脊索动物门,脊椎动物亚门,鸟纲,鸵鸟目,鸵鸟科,鸵鸟属。成年鸟身高240～280cm,体重130～200kg,腿长而粗,肌肉发达。鸵鸟已经失去飞翔能力,其主要运动是在陆地上行走和奔跑,奔跑时速一般为50 km/h左右,最高可达90～100 km/h。所以推测其腿骨在组织结构和生理功能上应与其它鸟类的有所不同。有关非洲鸵鸟骨骼的解剖学特征,前人已进行了研究,表明鸵鸟骨骼在结构形态上与其它鸟类的骨骼基本相似。但是关于非洲鸵鸟腿骨的是否有特殊的组织学特征,至今未见更为深入的相关报道。
　　 在鸵鸟的养殖过程中,6月龄以内的小鸵鸟很容易发生胫骨骨折,影响育成率,降低鸵鸟养殖业的经济效益。导致雏鸵鸟发生腿病的最重要病因就是营养因素,即日粮中钙、磷、维生素D等营养成分不足、或日粮中钙、磷含量的比例不当、或肠道对营养元素的吸收受到阻遏。同时,鸵鸟是世界上最大的鸟类,身体躯干部分的重量也很大；与其它鸟类相比,鸵鸟的生长速度很快,这就对钙、磷等营养元素有着更高的要求；同时又由于骨的生长发育要略慢于肌肉的生长发育。这就使得雏鸵鸟极易发生腿病,即胫骨的骨折或关节的变形等。雏鸵鸟的腿病在国内外每个鸵鸟场均有不同程度的发生,给鸵鸟产业造成了很大程度的威胁和经济损失。虽然国内外对鸵鸟的研究不断深入,但是这一问题仍然没有被有效地解决。
　　 硼,原子序数5,原子量10.811。越来越多的证据表明硼可以促进骨的生长发育。硼对骨生长的影响表现在影响软骨和骨结构、维生素D代谢和矿物质代谢等方面,它可以增加骨量和骨的抗骨折能力、可提高缺钙和缺镁大鼠大腿骨中骨灰分含量、能够提高血中钙、磷含量,并且对微量元素铁、铜、锌的代谢也有一定的促进作用。但尚未报道硼对雏鸵鸟的腿病问题是否有改善作用。
　　 综合以上三方面的因为,本课题利用大体解剖、骨磨片技术(结晶紫染色)、扫描电镜(SEM)技术、骨脱钙石蜡切片HE染色技术、细胞凋亡检测及图像分析技术、以及骨密度测定、蛋白质双向电泳技术、放射免疫法、原子吸收分光光度、流动注射分析综合手段,对非洲鸵鸟胫骨的形态学、雏鸵鸟胫骨发育的特征、患腿病雏鸵鸟胫骨病理变化及硼对雏鸵鸟胫骨发育的影响进行全面、系统的研究,旨在为非洲鸵鸟(尤其是雏鸟)的疾病防控及养殖业发展提供研究基础和理论依据。主要研究内容和研究结果包括以下4个方面:
　　 1.非洲鸵鸟胫骨形态学特征本试验以1岁非洲鸵鸟为试验动物,采用大体解剖、骨密度测量、骨磨片制作、骨脱钙石蜡切片制作、结晶紫染色、HE染色技术,研究非洲鸵鸟胫骨的形态学结构特征。结果显示:在非洲鸵鸟的胫骨外侧附着有腓骨,但腓骨呈现一种退化的迹象,在距远端关节7～10cm左右的地方与胫骨愈合在一起。在非洲鸵鸟的体内,胫骨独自支撑着身体的全部重量。鸵鸟胫骨的远端关节不能像人类的踝关节一样左右旋转,只能前后伸曲活动,这一解剖学特征更有利于承重,并有利于提高奔跑的速度和效率。1岁非洲鸵鸟胫骨的骨密度值很高,平均值为5.656 g/cm2,不同部位的骨密度值差别十分显著。胫骨组织中有大量骨盐沉积,十分坚硬。鸵鸟胫骨具有一个“过渡区”,位于外环骨板与骨单位的交接处,这个区域着色特殊。
　　 2.雏鸵鸟胫骨发育的特点本研究以1d、45d和90d健康非洲雏鸵鸟为试验动物,采用大体解剖、骨密度测量、扫描电镜、骨脱钙石蜡切片制作、HE染色技术,研究雏鸵鸟胫骨的发育特征。研究结果显示:1～90日龄雏鸵鸟胫骨的生长十分迅速。随着日龄的增长,雏鸵鸟胫骨的长度、重量、骨密度(BMD)的增长均为十分显著(P<0.01)。从显微水平和超显微水平上观察发现:在1日龄雏鸵鸟胫骨中,过渡型骨小梁构成了初级骨松质,由初级骨松质构成最初形成的骨干,大量成骨细胞贴附在软骨表面形成薄层初级骨松质,过渡型骨小梁十分菲薄。45日龄雏鸵鸟的胫骨中,骨组织的重吸收活动十分活跃,过渡型骨小梁正在被破骨细胞吸收并重建。同时,骨小梁中央的软骨基质钙化过程也十分活跃,软骨基质钙化区中软骨细胞逐渐退化,留下空泡状的宽大的陷窝。90日龄雏鸵鸟的胫骨中已经形成较厚的骨密质的雏形,但还不是真正意义的骨单位。在新形成的类似骨单位结构的最外周,已经形成了类似成型骨单位的粘合线,可以此来识别新形成的类似骨单位的结构。因此,在雏鸵鸟的饲养过程中,应加强对雏鸟饲养环境的维护和日粮的合理配比,保证雏鸟骨骼生长发育的需要。
　　 3.90日龄正常鸵鸟与患腿病鸵鸟胫骨差异本研究以90日龄健康正常的和患有腿病的雏鸵鸟为试验动物,利用骨密度测量、扫描电镜、骨脱钙石蜡切片制作、蛋白质二维电泳技术,揭示正常与患病雏鸵鸟的胫骨组织学与蛋白质水平的差异。试验结果显示:患有腿病的雏鸵鸟的骨密度值显著低于正常的雏鸵鸟。与正常雏鸵鸟胫骨的组织结构相比,患腿病雏鸵鸟胫骨骨小梁面积明显减少,骨小梁变细,且出现断裂消失的现象,骨小梁中间的软骨基质钙化活动也不如正常组的那样活跃；经扫描电镜观察,正常90日龄的雏鸵鸟胫骨的内表面有许多球状新生的骨组织,在新形成的类似中央管的管壁上,有许多骨小管的开口。而患腿病雏鸵鸟胫骨中的骨小梁多处出现微骨折现象,在骨组织观察面上、布满了大大小小的吸收坑。根据这些结果分析,患有腿病的雏鸵鸟虽然腿病各有不同,但基本上都会出现骨量变少和骨小梁微断裂现象。根据试验结果分析显示,患腿病的雏鸵鸟其病因可能为骨质疏松症。
　　 此外,本实验通过荧光差异凝胶电泳技术,对正常组与患病组的蛋白质样本进行了进行2D DIGE检测,并用DeCyder v.5.02图像分析软件对DIGE图像进行分析,通过对相匹配的蛋白质点丰度进行差异比较,筛选出154个具有显著性意义(P<0.05)的1.5倍以上的差异蛋白质点。之后计划对已筛选到的154个差异表达的蛋白质点进行酶切肽提取,之后进行质谱鉴定,并通过工具软件对蛋白质进行分类和功能分析,利用Western blot验证DIGE的结果。
　　 4.硼的添加对雏鸵鸟胫骨发育的影响本试验选取身高体重近似的45日龄雌性非洲鸵鸟饲喂45d之后,采用扫描电镜(SEM)技术、骨脱钙石蜡切片HE染色技术、细胞凋亡检测及图像分析技术、以及骨密度测定、放射免疫法、原子吸收分光光度、流动注射分析等方法观察硼对雏鸵鸟胫骨发育的影响。结果显示:添加硼饲喂之后使鸵鸟血清中的钙水平呈现下降趋势,血清中的磷水平先下降再升高,血钙和血磷的比值([Ca]/[P])出现先升高后降低的情况。血清中的瘦素水平逐渐升高,在添加200mg/L硼之后不再升高,而雌二醇的水平波动十分剧烈。添加少量硼时,血清中雌二醇的水平显著升高；但当硼的添加量达到200 mg/L时,其含量陡然下降,只比对照组略高；而当硼的添加量继续升高时,雌二醇水平又随之升高。在饮水中添加不同剂量的硼(A、B、C、D组鸵鸟的饮水中分别添加0 m/L、100 mg/L、200 mg/L、400mg/L)之后,4组鸵鸟的平均体重A组和C组基本持平,B组略高,D组最低；胫骨长度先出现显著的增长,之后又出现明显的下降；胫骨的重量也逐渐升高,C组的胫骨重量达到最高峰值,之后下降；胫骨周长持续增加；胫骨的灰分也随之持续增加；胫骨的骨密度先升高,而后陡然下降；胫骨骨髓腔的直径显著缩减,同时骨质的厚度也显著增加；此外,胫骨的骨髓腔不再居于胫骨的中央,而是位于靠近边侧的位置,即骨密质的最大值与最小值相差极为悬殊；4组的胫骨脱钙石蜡切片上用Tunel法检测出细胞凋亡情况,并用类流式细胞仪图像分析系统分析,得到的细胞凋亡检测结果显示,A、C两组细胞凋亡情况类似,而B、D两组中的细胞凋亡情况却显著高于B组,但T检验结果显示差异并不显著。
　　 由数据分析得出:B组的血清钙磷比最高,C、D组血清瘦素水平最好,C组雌二醇水平最优,B组体重数值最高,B、C组胫骨长度数值最高,C组胫骨重量数值最高,加硼组的胫骨周长均优于对照组,C、D组灰分占优,C组骨密度数值最高,骨密质厚度B、C组占优,A、C组凋亡细胞数量最少。综上所述,推测C组中雏鸵鸟胫骨发育的情况最为良好,即推测在4组不同剂量中,最适硼的添加量为200 mg/L。但真正的最适添加量仍需要更为严格的加硼梯度试验来进一步确定,以便更加有效地应用于鸵鸟饲养的生产实践中。