棉属四倍体及其供体基因组单染色体鉴别和rDNA定位

摘要

棉花是世界上重要的纤维经济作物,也是细胞遗传学、基因组学和进化研究的模式植物。目前其四倍体供体种尚存在争议,研究棉属四倍体及其供体种有利于了解棉属多样性和棉花全基因组测序,为在利用野生棉基因库中有目的地开采更多基因应用于棉花育种。染色体鉴别和rDNA定位是棉花基因组学研究的基础,也为棉属进化和确定四倍体棉供体种提供有力的证据。本文以两套陆地棉染色体特异BAC克隆(AhDh)为主体探针,结合D基因组着丝粒一个特异BAC克隆、45SrDNA和5S两种rDNA,对四倍体基因组及其二倍体供体的A和D两个基因组共18个棉种的单染色体进行FISH鉴别,将两个rDNA定位在特定的染色体和染色体臂上,并整合了遗传连锁图和物理图。
　　 本研究取得的主要结果如下:
　　 1、采用筛选自陆地棉A亚组单染色体所对应BAC克隆的13对特异SSR引物,分别对四倍体海岛棉和达尔文氏棉A亚组,以及二倍体A基因组草棉和阿非利加棉等4个基因组(亚组)进行PCR扩增；采用筛选自陆地棉D亚组单染色体所对应BAC克隆的13对特异SSR引物,分别对四倍体这两个棉种D亚组以及二倍体D基因组瑟伯氏棉、三裂棉、克劳茨基棉、戴维逊氏棉、辣根棉、旱地棉和雷蒙德氏棉等9个基因组(亚组)进行PCR扩增,以检测这两套SSR标记对于这13个基因组(亚组)的有效性。尽管PCR扩增产物出现了一些大小不一致的片段和非特异性片段,但总的结果证实了这些标记在相应的棉种基因组(亚组)中的存在,大部分标记能扩增出与预期对应的目的片段。这也说明了陆地棉A和D亚组两套BAC克隆(Ah01—Ah13和Dh01-Dh13)可以用作FISH标记,用来探讨四倍体海岛棉和达尔文氏棉A与D两个亚组,以及二倍体A与D两个基因组的单染色体鉴别。
　　 2、在有丝分裂中期,采用BAC-FISH(BAC克隆做探针的荧光原位杂交)分别鉴别了海岛棉和达尔文氏棉,以及瑟伯氏棉、三裂棉、克劳茨基棉、戴维逊氏棉、辣根棉、旱地棉和雷蒙德氏棉、草棉和阿非利加棉等11个棉种的全套单染色体。结果显示,Ah的13个特异BAC克隆都很好地定位在四倍体棉A亚组或A基因组棉种单染色体上,Dh的13个特异BAC克隆也都很好地定位在四倍体棉D亚组或D基因组棉种染色体上。在所鉴别的11个棉种中,雷蒙德氏棉比较特殊,有3个BAC克隆(48F11、78G20和78017)在多对染色体上出现杂交信号。因此,这两套陆地棉染色体特异BAC克隆作为上述棉种(雷蒙德氏棉除外)的单染色体鉴别标记是可靠的。通过四倍体A亚组间及其与A基因组间、D亚组问及其与D基因组间的同源转化关系,确定了这些棉种单染色体的命名:四倍体棉A(D)亚组At(Dt)染色体为At01-At13(Dt01-Dt13)；,海岛棉A(D)亚组染色体分别为Ab01-Ab13(Db01-Db13)；达尔文氏棉A(D)亚组染色体分别为Ad01-Ad13(Dd01-Dd13)；A基因组(Ag)染色体为Ag01-Ag13；草棉(A1)染色体为A101-A113；阿非利加棉(A1a)染色体为Ala01-A1a13；D基因组(Dg)染色体为Dg01-Dg13；瑟伯氏棉(D1)染色体为D101-D113；三裂棉(D8)染色体为D801-D813；克劳茨基棉(D3k)染色体为D3k01-D3k13；戴维逊氏棉(D3d)染色体为Dad01-D3d13；辣根棉(D2-1)染色体为D2-101-D2-113；旱地棉(D4)染色体为D401-D413和雷蒙德氏棉(D5)染色体为D501-D513。
　　 3、在有丝分裂中期,采用BAC-FISH以染色体Ah07、Ah09、Dh07和Dh09特异。BAC克隆鉴别了毛棉的部分单染色体,以及以染色体Ah05、Ah07、Ah09、Dh03、Dh07、Dh09和Dh12特异BAC鉴别了黄褐棉的部分染色体。结果显示这些BAC克隆都很好地定位在毛棉和黄褐棉染色体上。以染色体Ah05、Ah07和Ah09特异BAC克隆鉴别了亚洲棉的部分单染色体。以染色体Dh05、Dh07、Dh09和Dhl2特异BAC克隆分别鉴别了松散棉、施温迪茫氏棉和拟似棉的部分单染色体。结果显示这4个Dh特异BAC克隆都很好地定位在这3个D基因组棉种染色体上。通过四倍体D亚组间及其与D基因组间的同源转化关系,确定了这些棉种部分单染色体命名:毛棉A和D两个亚组染色体分别为Ato07、Ato09、Dto07和Dto09；黄褐棉A和D两个亚组染色体分别为Am05、Am07、Am09、Dm03、Dm07、Dm09和Dm12；亚洲棉(A2)染色体为A205、A207和A209；松散棉(D9)染色体为D905、D907、D909和D912；施温迪茫氏棉(D11)染色体为D1105、D1107、D1109和D1112；拟似棉(D6)染色体为D605、D607、D609和D612。
　　 4、基于单染色体鉴别,完成了棉属四倍体及其供体基因组共18个棉种的45S和5S两种rDNA的染色体及其臂位的鉴别分析。总体上,两种rDNA在所检测的棉种的位点数目、拷贝数、染色体位置和线性关系等有很多的一致性,也有多态性。四倍体棉基因组的45S rDNA都是3对,黄褐棉的都分布在A亚组染色体上(其中两对在染色体Am07和Am09上),其它4个四倍体棉种的染色体定位相同,都分别A与D两个亚组染色体上(At09、Dt07和Dt09)。二倍体A基因组3个棉种的45SrDNA,都是3对,在第5、7和9号染色体上(Ag05、Ag07和Ag09)。二倍体D基因组的45S rDNA,除了拟似棉只有2对(分布于染色体D607和D609)外,9个棉种都有3或4对,且大多数主要分布在第5、7、9和12号染色体上(Dg05、Dg07、Dg09和Dg12)。45S rDNA的拷贝数,在同一棉种的不同染色体上或不同棉种间相同序号的染色体上都存在差异。5S rDNA的拷贝数,除二倍体D基因组(Dg)明显多于四倍体D亚组(Dt)以外,在所研究棉种中在位点数目、拷贝数和染色体位置等高度保守,即都是只有一对位于第9号染色体上(At09/Dt09和Ag09/Dg09)。45S和5S两种rDNA的线性关系,在所检测的二倍体A、D基因组和四倍体A、D亚组上明显存在,仅黄褐棉D亚组特殊,不存在线性关系(黄褐棉D亚组上没有检测到45S rDNA)。
　　 5、本文研究了18个棉种rDNA定位,综合分析的结果支持四倍体D亚组为多起源的论点,认为黄褐棉与其它4个四倍体棉种的供体种不同。黄褐棉的供体种可能已经灭绝或未发现,而其它4个四倍体棉种的供体种可能是拟似棉、戴维逊氏棉、克劳茨基棉、辣根棉、旱地棉、松散棉和施温迪茫氏棉,可能不是雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉和三裂棉。四倍体A亚组的供体种可能是阿非利加棉。
　　 6、BAC克隆在不同棉种间(雷蒙德氏棉除外)的定位存在保守的共线性关系,说明了D基因组与四倍体D亚组间、A基因组与四倍体A亚组间分别存在大片段的染色体同源区段。通过遗传图与物理图的对比分析,调整了四倍体棉种D亚组的遗传图(Dt03、04、06、09、10和12)的排列方向,并发现尽管染色体Dt04上的SSR标记存在于连锁群的中间,但相应的BAC却由FISH定位到了对应染色体的近末端。
　　 7、有3个单染色体特异BAC(48F11、78G20和78017)在雷蒙德氏棉染色体上没有出现预期的单染色体特异杂交信号,而在多对染色体上出现杂交信号。这种非染色体特异的验证结果,表示雷蒙德氏棉染色体间部分同源现象更突出,部分同源片段更多。雷蒙德氏棉第7和11号染色体(D507和D511)上的BAC克隆在染色体上的位置也与其它棉种的不同,说明这两条染色体上可能存在染色体重排事件。这些都表明雷蒙德氏棉在D基因组中是一个非常特殊的棉种。