深海细菌Aeromonas sp.HC11e-3B-葡萄糖苷酶的克隆、表达,生化特性以及定点突变

摘要

β-葡萄糖苷酶可以广泛应用于多种工业领域,如在纤维素的降解中,辅助外切纤维素酶和内切纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖单糖；在食品工业中,水解果汁,茶汤中的芳香基糖苷类化合物,起到自然增香的效果；在医药工业中,水解中药活性成分的糖苷前体,制备有活性的中药成分；同时β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性使得它在合成糖苷类活性物质上具有很好的应用前景,如利用β-葡萄糖苷酶合成表面活性剂烷基糖苷和益生元龙胆聚糖等。因此新的β-葡萄糖苷酶克隆与开发对于相应的工业应用领域具有重要意义。
　　 本研究从实验室库存的海洋细菌中,筛选得到一株高产β-葡萄糖苷酶的海洋气单胞菌Aeromonas sp.HClle-3。通过鸟枪法构建基因组文库,首次从该细菌中克隆得到一个β-葡萄糖苷酶基因,全长2382bp,编码793个氨基酸,将其命名为Bg1A。同源比对发现该酶隶属于糖苷水解酶第三家族,与来源于新阿波罗栖热袍菌Thermotoga neapolitana的同源性为45％,与其他已经报道生化特性的糖苷酶同源性不高于30％。
　　 将该酶基因克隆到pGEX-6p-1载体上,转化于大肠杆菌表达宿主中,利用IPTG诱导表达该酶,发现该酶在0.1mM的IPTG诱导剂,18度的培养温度下,在E.coliBL21(DE3)中表达良好。利用GST亲和纯化系统,纯化该酶,并测定其酶学性质,发现该酶在pH6.0和55℃条件下表现出最高活性。该酶特异性的水解芳香基糖苷,对人工合成的硝基酚葡萄糖苷,以及植物来源的葡萄糖苷七叶苷和熊果苷显示出最高的活性,对硝基酚木糖苷和硝基酚半乳糖苷也有微弱的活性。Bg1A有广泛的金属离子和化学试剂都具有很高的耐性。Ca2+,Mn2+,Zn2+,Ba2+,pb2+,Sr2+对该酶有激活作用,SDS,EDTA,DTT对该酶有轻微的抑制。同时在0.5M的高葡萄糖浓度下,Bg1A仍表现出一定的活性,表明该酶有很强的葡萄糖耐受功能。总体来说,该酶是一个易于重组表达,同源性低,底物专一性强,对化学试剂耐受性强的β-葡萄糖苷酶。这些特性使得该葡萄糖苷酶能够被用在合适的工业领域。
　　 通过同源比对和结构模拟,推定该酶可能的活性位点为天冬氨酸288位和谷氨酸495位。利用重叠延伸定点突变技术将该酶的天冬氨酸288位和谷氨酸495位突变为丙氨酸,结果突变体D288A和E495A的活性分别降低820倍和4920倍,证实了Asp288和Glu495参与该酶的活性水解。这些结果为该家族其它葡萄糖苷酶活性位点的功能分析提供了一定的依据。