牛支原体LAMP检测方法的建立及体外传代致弱菌株的特性鉴定

摘要

牛支原体（Mycoplasma bovis, M.bovis）是引起奶牛及肉牛多种疾病的重要病原菌。由于牛支原体引起的疾病没有典型症状，且常与其他致病菌混合感染，病情复杂，所以极易被忽视。随着科技的进步以及对该病的不断探索，人们越来越意识到牛支原体的危害性。自1961年首次分离到牛支原体以来，世界上大多数国家都已经发生过牛支原体相关疾病的暴发。到目前为止，没有很好的药物来治疗牛支原体引起的肺炎、乳房炎、关节炎等相关疾病。疫苗的应用也只停留在传统的灭活疫苗，且效果并不理想。2008年我国首次报道了牛支原体肺炎的暴发，经济损失惨重。由于我国养牛模式使牛在不同区域间频繁调动，加速牛支原体的传播，造成了牛支原体病在各个地区不断的暴发，给养牛业造成巨大经济损失。
　　本课题根据牛支原体特异性基因uvrC建立了一种环介导等温核酸扩增检测方法，为牛支原体病的快速诊断提供方法。同时通过体外连续传代的方法对牛支原体野毒株进行致弱，并进行毒力评价，从而为研究牛支原体毒力因子及弱毒疫苗奠定基础。具体的研究内容如下：
　　1.牛支原体环介导等温扩增方法的建立
　　环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是在恒温条件下对目的基因扩增，该方法特异性好、灵敏度高，时间短、操作简单。根据牛支原体特异性基因uvrC设计出LAMP所需的四条引物，建立了牛支原体LAMP检测方法。该方法有很好的特异性，与其他支原体及呼吸道常见菌无交叉反应。该方法检测牛支原体的灵敏度可以达到34 CFU，比普通PCR高10倍。在对98份临床样本的检测中，LAMP有较高的检出率，其中对发病牛临床样本的阳性检出率为92%，而PCR的阳性率为49%；在39份健康牛样本中，LAMP和PCR的的检测结果均为阴性。本研究建立的牛支原体LAMP检测方法较传统的PCR灵敏性更高且检测时间短，且适合于临床样本的检测。
　　2.牛支原体体外传代致弱菌株的特性鉴定
　　将牛支原体临床分离株MbovHB0801做为原代菌株进行传代培养。MbovHB0801株已经通过前期实验充分证明其为牛支原体，且有较强的致病性。比较F115代与F1代菌株生长曲线无显著差异，通过SDS-PAGE及Western blot比较有多处蛋白条带产生差异性。用F1、F115、F150.1和F150.2四个不同代次的菌株按1010CFU、1011CFU、3×1011CFU三个不同的感染量来感染牛，通过观察临床症状，测定体温、血常规、血清抗体、血清IFN-β和IFN-γ以及鼻拭子排菌等指标评价菌株的毒力和免疫原性。结果发现，150代的菌株毒力已经降低，临床症状轻微，其中F150.2代效果最显著。
　　F150.2代菌株感染牛体重较F1代菌株感染牛体重有显著增加（P＜0.01），肺部病变打分较低，与对照组差异不显著（P＞0.05），而与F1代感染组有较显著差异（P＜0.05），血常规指标表明接种牛不发生严重的炎症反应，且可以很好的诱导抗体反应，感染后6天IFN-β值可以达到414pg/mL，与F1代感染组相当。综合比较，该代次菌株毒力较弱且保持良好的的免疫原性，提示该弱毒菌株可作牛支原体弱毒疫苗的侯选菌株，为牛支原体新型疫苗的研发奠定了基础。

目录

声明

缩略词（Abbreviation）

第1章 文献综述

1.1 病原学研究进展

1.2 临床症状及病理变化

1.3 致病机制研究

1.4 诊断方法研究

1.5 防治方法研究

1.6 免疫应答及疫苗研究

1.7 流行现状及对经济的影响

1.8 目的及意义

第2章 牛支原体LAMP检测方法的建立

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果及分析

2.4 讨论

第3章牛支原体体外传代致弱菌株的特性鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

附录硕士研究生阶段成果