PRRSV感染激活IL-10产生的信号通路

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起，广泛分布于世界各养猪国家，给养猪业造成了巨大的经济损失。虽然自1987年首次发现该病以来人们对PRRS病毒开展了广泛的研究，并取得了一系列有意义的进展，但在病毒的分子致病机理和免疫机制等方面，人们还知之甚少，这也是目前研制安全、高效疫苗的主要障碍。白细胞介素10(IL-10)是一种多能的、在免疫调节和宿主防御反应中具有广泛效应的分子，研究发现激活IL-10的表达是多种病毒建立持续感染的一种十分有效的策略。那么PRRS病毒是否也通过上调IL-10的表达逃避宿主的免疫应答呢？为了阐明这一问题，开展了如下研究：
　　 1.PRRSV感染PAM细胞在mRNA水平和蛋白水平激活IL-10的表达
　　 通过real-time RT-PCR和ELISA检测PRRSV感染PAM细胞后不同时间点IL-10的表达情况，发现PRRSV感染后6h在mRNA和蛋白水平即显著上调IL-10的表达，并随着感染时间的延长，上调倍数逐渐增高。进一步以紫外灭活的PRRSV和不同剂量活的PRRSV分别感染PAM细胞，发现紫外灭活的PRRSV和未灭活的PRRSV均可诱导IL-10的产生，并且PRRSV剂量越高对IL-10的上调作用越显著，可见PRRSV诱导IL-10的表达存在病毒剂量依赖性。说明PRRSV编码的蛋白参与IL-10的激活，而且IL-10的激活与PRRSV的复制增殖密切相关。
　　 2.PRRSV诱导IL-10表达依赖MyD88，与TRIF、RIG-I无关
　　 设计干扰分子psiTRIF、psiMyD88、psiRIG-I分别转染PAM细胞，转染psiMyD88后，无论是在转录水平还是蛋白水平均可下调PRRSV诱导的IL-10表达，而转染psiTRIF、psiRIG-I并不影响PRRSV诱导的IL-10表达。利用IL-10荧光素酶报告系统检测PRRSV感染Marc-145细胞和HEK293-CD163细胞后IL-10的表达情况，发现PRRSV感染Marc-145细胞可诱导IL-10的上调，48h尤为明显；而PRRSV感染HEK293-CD163细胞，IL-10的表达无明显上调，而HEK293-CD163缺乏TLRs，由此说明PRRSV感染诱导IL-10的产生与TLRs模式受体相关，并且依赖于MyD88，而与TRIF，RIG-I无关。
　　 3.PRRSV激活IL-10的产生与转录因子NF-κB有关
　　 用不同浓度(1μM、5μM、10μM、20μM)的NF-κB抑制剂BAY11-7082处理PAM细胞，PRRSV感染48h后收样，real-time RT-PCR和ELISA检测发现BAY11-7082处理显著下调PRRSV诱导的IL-10表达，并存在剂量依赖性；而抑制IκBα后PRRSV诱导的IL-10表达水平显著上调，由此可见，NF-κB参与调控PRRSV上调IL-10的产生。
　　 4.PRRSV感染PAM细胞激活IL-10的产生与p38/MAPK通路有关
　　 用MAPK三条通路的特异性抑制剂SP600125、U0126、SB202190分别处理PAM细胞，PRRSV感染48h后收样，real-time RT-PCR和ELISA检测IL-10的表达水平，发现抑制剂SB202190对PRRSV诱导IL-10表达的抑制作用明显，U0126处理后IL-10的表达水平无明显变化，而高浓度的SP600125反而能促进IL-10的激活。SB202190对IL-10表达的抑制作用随抑制剂浓度的升高而逐渐增强。说明p38通路参与了PRRSV感染PAM细胞上调IL-10的过程，ERK1/2和JNK信号通路可能不参与PRRSV诱导IL-10的激活。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表(ABBREVIATION)

第1章 文献综述

1.1 猪繁殖与呼吸综合征

1.2 细胞因子

1.3 白细胞介素10

1.3.1 白细胞介素10与白细胞介素10家族

1.3.2 白细胞介素10的生物学活性

1.3.3 白细胞介素10与病毒感染

1.4 TLRs信号转导途径

1.5 RIG－Ⅰ/MDA－5/LGP2信号通路

1.6 NF-κB信号转导途径

1.7 MAPK信号转导途径

第2章 研究目的与意义

第3章 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 毒株、细胞与菌种

3.1.2 载体与质粒

3.1.3 工具酶和试剂

3.1.4 特异性抑制剂及其配制

3.1.5 干扰分子及其配制

3.1.6 培养基配制

3.2 试验方法

3.2.1 PRRSV的扩增

3.2.2 病毒滴度的测定

3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3.2.4 连接产物的转化

3.2.5 质粒的制备与鉴定

3.2.6 质粒转染(脂质体介导转染法)

3.2.7 细胞样品总RNA的提取

3.2.8 cDNA的合成

3.2.9 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR

3.2.10 相对mRNA表达水平的计算

3.2.11 ELISA检测方法

3.2.12 双荧光素酶检测方法

3.2.13 统计学方法

第4章 结果与分析

4.1 PRRSV感染PAM细胞在mRNA和蛋白水平上激活IL-10表达

4.1.1 PRRSV感染PAM细胞激活IL－10的时间动力学分析

4.1.2 PRRSV感染PAM细胞激活IL－10呈剂量依赖性

4.2 PRRSV诱导IL－10表达依赖MyD88，与TRIF、RIG－Ⅰ无关

4.3 PRRSV激活IL－10的产生与转录因子NF－κB有关

4.4 PRRSV感染PAM细胞激活IL－10产生与p38/MAPK通路有关

第5章 讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 PRRSV感染PAM细胞在mRNA和蛋白水平上激活IL－10表达

5.1.2 PRRSV通过转录因子NF-κB激活IL－10

5.1.3 MAPK通路参与PRRSV激活IL－10

5.1.4 IL－10在猪繁殖与呼吸综合征中的免疫调节作用

5.2 结论

参考文献

致谢