褐飞虱微卫星标记筛选及东南亚地理种群遗传结构研究

摘要

褐飞虱Nilaparvata lugens(St(M)l)属于同翅目(Homoptera)飞虱科(Delphacidae)，其分布广泛，经济危害严重，是东南亚水稻种植区的主要迁飞性害虫之一。相关研究表明褐飞虱仅能在我国少数地方越冬，境外迁入的褐飞虱种群是造成暴发的重要原因之一。为做好褐飞虱的预测预报和防治工作了解该种害虫不同地理种群的遗传结构、探讨各种群间的亲源关系十分必要。
　　本研究采用富集文库法筛选出了高多态性的微卫星标记，并采用其中5个微卫星标记与1个线粒体基因序列标记相结合的方法，对采自东南亚10个不同地区的褐飞虱进行了系统的地理种群结构研究，获得了如下结果:
　　1.采用探针(AG)15、(AC)15通过磁珠富集法筛选微卫星位点，实验中共测序阳性克隆96个，阳性克隆产率为80.2％，筛选到了77个含有简单重复的序列;根据微卫星侧翼保守序列共合成31对微卫星引物，经鉴定其中21对可用，并且有16对微卫星引物具有较好的多态性，统计表明该16个微卫星位点以AG/GA为重复单位的占37.5％，以TC/CT为单位的占56.3％，以GAGT为单位的占6.3％。
　　2.采用5个微卫星位点检测了国内外10个褐飞虱地理种群（每个种群24个个体），同时采用线粒体COI基因扩增了上述褐飞虱地理种群（每个种群10个体）。在5个微卫星位点中，共检测到96个等位基因，各种群中平均等位基因数从8.6-11.2不等。平均期望杂合度与平均观察杂合度分别介于0.7148-0.8172和0.5917-0.7584之间，属较高水平。多态信息含量PIC分布于0.5570-0.9227之间，平均多态信息量为0.7624。哈温平衡与连锁不平衡检测显示各地理种群哈温平衡偏离常数均发生了不同程度的偏离，微卫星位点间只有一对(Z107与Z304)位点存在显著的连锁不平衡关系。在线粒体COI基因中，共定义了18个COI基因单倍型。各单倍型间的遗传距离范围在0.0010-0.3000之间，平均遗传距离为0.0700。核苷酸分歧度分与净核苷酸分歧度分别分布在0.0005-0.2032和0.0000-0.1590之间。两种分子标记的指标参数都显示出较好的遗传多样性，获得的数据均可用于种群结构分析。
　　3.基于微卫星标记和线粒体COI基因序列对10个褐飞虱地理种群间遗传分化指数FST值与遗传距离分析表明，腾冲种群与菲律宾种群各自与其它褐飞虱地理种群间都出现了显著的遗传分化。以微卫星标记得到的种群间遗传分化指数FST值与遗传距离分别在0.0015-0.1214和0.0067-0.5568之间，以mtDNA COI基因序列计算的遗传分化指数FST值遗传距离分别介于0.0000-0.7857和0.0000-0.2030之间。
　　4.通过分析基于微卫星标记遗传距离数据构建的UPGMA树与依据线粒体标记遗传距离生成的NJ树得出以下结论:各地理种群中大冶、文山、龙洲、勐海、南靖、海南、越南、泰国8个种群之间遗传距离较小，遗传分化不显著、亲源关系较近，聚为一个大类群。腾冲种群与其它地理种群间的遗传距离较大、基因交流较少、亲源关系较远聚为一个类群。菲律宾种群与除腾冲种群外的地理种群间存在一定的遗传分化，但不显著，单独聚为一个类群。从以上结论可以推断越南北部和越南南部匀可以为国内稻区提供虫源，与前人研究结果一致;前人认为泰国虫源对我国影响较小，但本文的结果表明此部分虫源对我国的影响不可忽视;本文的结果还表明菲律宾虫源可影响我国，但在程度上远不及中南半岛虫源;值得注意的是，云南西部的虫源与其它东南亚种群皆存在明显的遗传差异，因此可把云南西部及云南西部以西的区域的虫源（包括缅甸和孟加拉虫源）排除在东南亚褐飞虱迁飞体系之外。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 褐飞虱的危害

1．2 褐飞虱的分布、迁飞与虫源地

1．3 褐飞虱迁飞、虫源地研究进展

1．4 遗传多样性

1．5 遗传多样性的研究方法

1．6 微卫星DNA标记与昆虫遗传多样性研究

1．6．1 微卫星DNA序列的结构

1．6．2 微卫星DNA序列的多态性

1．6．3 微卫星DNA标记的特点

1．6．4 微卫星DNA标记的筛选方法

1．7 线粒体DNA标记与昆虫遗传多样性研究

1．7．1 昆虫mtDNA的结构

1．7．2 mtDNA用于遗传多样性研究的优点

1．7．3 mtDNA COI基因及其应用

1．8 研究的目的与意义

第二章 褐飞虱微卫星标记的筛选

2．1 材料的采集

2．2 主要的仪器

2．3 主要的试剂

2．4 实验方法

2．4．1 基因组DNA的提取

2．4．2 基因组DNA的酶切

2．4．3 酶切产物的链接

2．4．4 链接产物PCR扩增

2．4．5 PCR产物纯化

2．4．6 杂交与磁珠富集微卫星片段

2．4．7 杂交富集产物的PCR扩增

2．4．8 PCR产物纯化

2．4．9 连接

2．4．10 转化、涂板

2．4．11 筛选

2．4．12 阳性克隆的鉴定

2．4．13 测序与引物设计

2．4．14 优化与检测设计的引物

2．4．15 非变性聚丙烯烯酰胺凝胶电泳检测引物多态性

2．5 结果与分析

2．5．1 基因组DNA的提取

2．5．2 基因组DNA酶切结果

2．5．3 连接产物PCR预扩增结果

2．5．4 杂交富集产物扩增结果

2．5．5 PCR产物纯化结果

2．5．6 阳性克隆鉴定结果

2．5．7 阳性克隆的测序

2．5．8 引物设计

2．5．9 微卫星引物多态性的初步鉴定

2．6 小结与讨论

第三章 基于SSR标记的褐飞虱不同地理种群遗传结构研究

3．1 材料的采集

3．2 实验方法

3．2．1 基因组DNA的提取

3．2．1 用于荧光标记STR分型的微卫星引物的筛选

3．2．3 荧光标记引物PCR扩增

3．2．4 STR分型

3．2．4 软件与数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同地理种群褐飞虱基因组DNA的提取

3．3．2 具有不同地理种群多态性的微卫星引物筛选

3．3．3 不同褐飞虱地理种群微卫星位点的STR分型

3．3．4 哈德-温伯格平衡与连锁不平衡检测

3．3．5 微卫星位点遗传多样性分析

3．3．6 不同地理种群褐飞虱种群结构分析

3．4 小结与讨论

第四章 基于mtDNA COI分子标记的褐飞虱不同地理种群结构研究

4．1 材料的采集

4．2 实验方法

4．2．1 基因组DNA的提取

4．2．2 mtDNA COI基因扩增

4．2．3 PCR产物纯化测序

4．2．4 软件与数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 不同地理种群褐飞虱mtDNA COI基因PCR扩增结果

4．3．2 不同地理种群褐飞虱mtDNA COI基因属性

4．3．3 单倍型的定义

4．3．4 单倍型的分布

4．3．5 褐飞虱18个单倍型间遗传距离及系统发生关系

4．3．6 各地理种群内mtDNA COI核苷酸多样度和单倍型多样度

4．3．7 各地理种群间核苷酸分歧度(Dxy)与净核苷酸分歧度(Da)

4．3．8 遗传距离及系统发生关系

4．4 小结与讨论

第五章 结论与展望

5．1 研究结论

5．2 论文创新点

5．3 研究展望

参考文献

致谢