2型猪链球菌表面蛋白Hp0272参与逃逸宿主天然免疫的分子机制研究

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis)属于兰氏(Lancefield)分类法的R群，能够感染人和猪，是重要的新发传染病病原体。35个血清型中以2型(Streptococcus suis serotype 2，SS2)流行最广，致病性最强。SS2表面假说蛋白0272(hypothetical protein 0272，Hp0272)，作为粘附配体分子还具有强免疫原性，可作为候选的疫苗分子，该蛋白具有增强猪链球菌逃逸宿主天然免疫及抗吞噬杀伤的功能，但其分子机制还不清楚。
　　 本研究建立了猪链球菌-人血清相互作用模型，利用流式细胞术(fluorescence activted cell sorter，FACS)分析确定了猪链球菌激活补体的途径，通过比较SS2强毒力株05ZYH33，突变株△0272和互补株C△0272表面补体的沉积，确定Hp0272在猪链球菌抑制替代补体途径激活中的作用，验证了Hp0272与人替代补体途径的负调节子H因子(human Factor H，hFH)的相互作用以及该相互作用对抑制人血清补体激活的影响；重组纯化了GST(glutathione S-transferase)标签Hp0272融合蛋白，通过GST-Pulldown技术初步研究了Hp0272与hFH的结合方式及其与其他血浆蛋白的结合。揭示了Hp0272在猪链球菌逃避宿主天然免疫反应，抗吞噬杀伤中的功能及分子机制。具体结果如下：
　　 1.Hp0272对猪链球菌激活人血清补体的影响
　　 通过流式细胞术分析比较了SS2强毒力株05ZYH33，突变株△0272和互补株C△0272表面补体(C3b/iC3b和iC3b)沉积，发现血清浓度为50%时，△0272表面沉积的C3b/iC3b(荧光指数(fluorescence index，FI)=(10.7±5.0)×107)显著高于05ZYH33(FI=(3.8±0.2)×107)和C△0272(FI=(4.6±2.1)×107)，而△0272表面结合的iC3b(FI=(3.5±0.2)×106)显著低于05ZYH33(FI=(5.7±0.0)×106)和C△0272(FI=(4.2±0.0)×106)。提示Hp0272对猪链球菌激活人血清补体的过程中有抑制，△0272表面结合的iC3b显著低于05ZYH33和C△0272，提示Hp0272很可能与补体途径的负调节子有相互作用，将C3b降解为iC3b。
　　 2.猪链球菌激活人血清补体的途径分析
　　 构建FACS模型，并从抗体浓度方面优化了该模型，采用此模型通过经典(classical pathway，CP)，替代(alternative pathway，AP)和凝集素(lectin pathway，LP)途径抑制剂进行抑制实验，发现经典途径和凝途径的抑制剂均不能起到抑制作用，而替代途径的抑制剂能抑制90%以上的C3沉积，说明猪链球菌主要通过替代途径激活补体，进一步推测Hp0272可能与hFH结合。
　　 3.Hp0272与hFH相互作用的鉴定
　　 采用配体印迹的方法鉴定到Hp0272与人血清中的hFH的特异性结合但不结合纯的hFH蛋白，提示Hp0272与hFH的结合可能是间接结合。通过FACS进行了菌株原位水平的验证，即结合到△0272表面的hFH(FI=(0.7±0.2)×106)显著低于05ZYH33(FI=(1.4±0.3)×106)和C△0272(FI=(2.4±0.6)×106)；抗hFH抗体阻封实验发现05ZYH33和C△0272 hFH封闭后补体结合量提高到2-3倍，而△0272无显著变化，说明Hp0272与hFH的结合抑制猪链球菌表面补体的激活。
　　 4.Hp0272与hFH的结合方式及Hp0272与其他血浆蛋白配体的鉴定
　　 构建立了pGEX-4T-1-0272的重组质粒，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21，表达并纯化GST-Hp0272融合蛋白。采用此蛋白进行特异性强的GST-Pulldown，选取两条差异点进行质谱分析，结果发现其中一条为hFH与C3d的复合物，提示C3d介导了Hp0272与hFH的结合。另一条为人血浆激肽原，同时通过ELISA初步鉴定到Hp0272能与hIgG和hIgA结合，且结合位点位于Hp0272 N端41-318aa区域内。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 猪链球菌

1.1 猪链球菌的分类

1.2 猪链球菌的生物学性状

1.3 猪链球菌的流行病学

1.4 中国猪链球菌病的新特点

1.5 猪链球菌致病机制研究进展

1.6 猪链球菌主要相关毒力因子

2 革兰氏阳性病原菌MSCRAMM研究进展

2.1 MSCRAMM的简介

2.2 MSCRAMM在致病过程中的作用

2.32型猪链球菌MSCRAMM Hp0272研究进展

3 研究的目的和意义

第二章 2型猪链球菌表面蛋白Hp0272与hFH结合的鉴定及其生物意义

1 材料

1.1 主要菌株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器与设备

2 方法

2.1 血清的制备

2.2 猪链球菌－人血清相互作用模型的构建及优化

2.3 表面蛋白Hp0272对猪链球菌表面C3b/iC3b和iC3b沉积的影响

2.4 猪链球菌激活补体途径分析

2.6 特异性羊抗hFH阻封实验

2.7 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 猪链球菌－人血清相互作用模型的构建及优化

3.2 表面蛋白Hp0272对猪链球菌激活补体的抑制作用

3.3 猪链球菌通过替代途径激活补体

3.4 Hp0272结合hFH的鉴定

3.5 Hp0272结合hFH抑制了补体的激活

4 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第三章 GST-Hp0272的表达纯化及其与宿主细胞外基质结合的验证

1 材料

1.1 菌株和质粒

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 重组质粒的构建及质粒转化

2.1 重组质粒pGEX-4T-1－0272在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

2.2 GST pull－down筛选人血浆蛋白及LC－MASS鉴定

2.3 GST-Hp0272结合hIgG和hIgA的鉴定

3 结果与分析

3.1 重组质粒pGEX-4T-1-Hp0272的构建及鉴定

3.2 重组蛋白GST-Hp0272的表达，纯化及Western印迹鉴定

3.3 GST pull-down筛选人血浆蛋白及LC-MS鉴定

3.4 重组蛋白GST-Hp0272结合人血浆IgG和IgA的鉴定

4 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第四章 结论与展望

1 结论

2 展望

3 创新点

参与文献

致谢

附 录

附录Ⅰ 在读硕士期间发表文章

附录Ⅱ 试剂盒操作步骤

附录Ⅲ 主要试剂的配制