骨骼肌发育中miR-145a功能与qPCR内参基因的研究

摘要

本文围绕骨骼肌发育这一主题集中探讨了两个问题：miR-148a在骨骼肌发育中的作用及其作用机理；不同发育时期猪骨骼肌基因表达分析技术qPCR中内参基因的选择。主要工作及结果如下：
　　 1.骨骼肌发育中miR-148a的功能研究
　　 MicroRNA(miRNA)是一类进化上保守的非编码小分子RNA。这类小RNA通过降解靶基因mRNA或者阻滞蛋白质翻译，调控基因的表达。它们在早期发育、细胞增殖、分化和凋亡等一系列生物学过程中发挥着极其重要的作用。
　　 在前期应用深度测序技术(Deep Sequencing Approach)筛选出一系列在猪的胚胎和成年骨骼肌不同发育时期差异表达的miRNAs的研究工作中，我们发现miR-148a在胚胎时期的骨骼肌组织中高表达，但在成年猪的骨骼肌中几乎不表达。目前已经报道miR-148a与癌症相关，但它在骨骼肌发育中的功能迄今还未见报道。
　　 在本研究中，我们从多个方面探讨了miR-148a在骨骼肌发育中的功能。我们发现并证实miR-148a能促进成肌细胞分化并一定程度阻滞细胞周期，以及miR-148a是通过抑制RhoA/ROCK信号通路中ROCK1的表达，从而实现对肌肉分化的正向调控。
　　 (1)我们首先建立了C2C12细胞体外分化模型，通过对miR-148a在分化第0天、1天、3天和5天表达的定量检测，发现miR-148a随着C2C12分化上调表达。
　　 (2)通过对过表达miR-148a后的C2C12细胞进行全基因组表达谱芯片分析，发现miR-148a过表达促进了一系列肌肉特异性基因的上调，并利用qPCR检测了6个上调表达的肌特异性基因(Tnnt3、Mb、Mylpy、Myom3、myogenin和IGF2)的表达，验证了芯片检测结果。
　　 (3)诱导过表达或抑制miR-148a后C2C12和骨骼肌原代细胞分化，并检测分化标志基因MHC、myogenin和Skeletalα-actin在mRNA和蛋白水平上的表达变化。结果表明：过表达miR-148a后分化标志基因上调，反之抑制miR-148a后分化标志基因下调，因此证明miR-148a能够促进成肌细胞分化，具有正向调控肌肉分化的功能。
　　 (4)应用CCK-8细胞增殖检测方法分析miR-148a对C2C12细胞增殖的作用，结果表明过表达或抑制miR-148a对细胞增殖没有影响；应用流式细胞术分析miR-148a对C2C12细胞周期的影响，在C2C12中过表达miR-148a，发现miR-148a实验组中处于G1期的细胞比例显著高于对照组(P<0.05)，而处于S期的细胞比例显著低于对照组，说明miR-148a加强了G0/G1期的细胞阻滞，有利于肌细胞分化。
　　 (5)在探明miR-148a促进成肌细胞分化后，我们应用TargetScan和miRanda软件对miR-148a的靶标基因进行预测，筛选出候选靶标ROCK1基因(一种分化抑制基因)。通过双荧光素酶报告基因实验确定了ROCK1的3'UTR(非翻译区)含有miR-148a的作用靶位点，同时运用qPCR和western blot验证了miR-148a抑制ROCK1的蛋白翻译，而不影响其转录。
　　 (6)运用siRNA干扰C2C12和骨骼肌原代细胞内源性ROCK1后，其表达受到抑制，而分化标志基因的表达上调，这一结果说明ROCK1是分化抑制基因，而且干扰ROCK1表达可促进肌细胞分化。
　　 2.骨骼肌基因表达分析qPCR中内参基因的选择
　　 在基因表达分析，如定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)中，通常用内参基因(reference gene)来校正目标基因的表达量。理想的内参基因应在各种实验因素条件下都恒定表达。但大量的研究结果证明，在不同组织、不同发育阶段和不同实验条件下，内参基因的表达都存在不同程度的变化。因此，在基因表达转录分析qPCR中，选择合适的内参基因用于目标基因表达量的校正，是得到准确可靠数据的关键。
　　 本研究主要探讨了猪不同组织和不同发育时期骨骼肌基因表达qPCR分析中内参基因的选择。我们首先应用qPCR技术检测6个候选内参基因(GAPDH、ACTB、H3F3A、HPRT1、RPL32和RPS18)，在通城猪和长白猪不同组织和不同胚胎时期骨骼肌(胚胎期第33天、65天和90天)中的表达量。通过运用NormFinder、BestKeeper和geNorm三种软件评价这些候选内参基因的表达稳定性。我们的结果表明，这6个候选基因在不同猪种、不同组织和不同发育阶段的骨骼肌中都存在表达的不稳定性，但其中表达较为稳定的基因是RPS18、PRL32和H3F3A。
　　 本研究同时探讨了以上3个内参基因的组合。结果表明：在通城猪骨骼肌不同发育时期的基因表达分析中，H3F3A和RPS18是最合适的内参基因组合；在长白猪骨骼肌不同发育时期的基因表达分析中，PRL32和RPS18是最合适的内参基因组合；在通城猪和长白猪的不同组织中，PRL32和RPS18表达相对稳定，再联合H3F3A一起可作为较合适的内参基因组合。因此，本研究为猪的基因表达转录分析qPCR提供了几组较为可靠的内参基因组合方案，可用来比较准确地校正目标基因的表达量。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表(Abbreviations)

第一章 骨骼肌发育中miR-148a功能研究

1 前言

1.1 研究问题的由来

1.2 文献综述

1.3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 C2C12体外分化

3.2 miR-148a在C2C12成肌细胞分化过程中呈上调表达

3.3 miR-148a促进C2C12成肌细胞分化

3.4 miR-148a促进骨骼肌原代细胞的分化

3.5 miR-148a对C2C12成肌细胞增殖的影响

3.6 miR-148a对C2C12成肌细胞的细胞周期影响

3.7 过表达miR-148a C2C12细胞的全基因组表达谱分析

3.8 miR-148a靶标基因ROCK1的验证

3.9 干扰ROCK1对C2C12和骨骼肌原代细胞分化的影响

4 讨论

4.1 miR-148a正向调控肌肉分化

4.2 miR-148a加强细胞周期G1期的阻滞但不影响细胞的增殖

4.3 miR-148a抑制靶标基因ROCK1的蛋白表达

4.4 ROCK1对成肌细胞分化的抑制作用

5 小结

5.1 本研究的主要结果与结论

5.2 本研究的创新点与特色

5.3 本研究不足之处与进一步工作的建议

第二章 骨骼肌基因表达分析qPCR中内参基因的选择

1 前言

1.1 研究问题的由来

1.2 文献综述

1.3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 总RNA的提取

3.2 六个候选基因的PCR扩增产物

3.3 实时荧光定量PCR扩增曲线图

3.4 六个候选内参基因的表达水平

3.5 NormFinder程序对候选基因稳定性分析

3.6 BestKeeper程序对候选基因稳定性分析

3.7 geNorm程序对候选基因稳定性分析

4 讨论

5 小结

5.1 本研究的主要结果与结论

5.2 本研究的创新点与特色

5.3 本研究不足之处与进一步工作的建议

参考文献

攻读学位期间撰写论文题录

致谢