S5位点调控水稻籼粳杂种不育的分子细胞学机理研究

摘要

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。由于耕地面积的不断减少和人口的持续增长，粮食问题依然严峻。籼稻和粳稻的杂种F1具有更大的杂种优势，但限于其普遍存在的结实率低的现象，使得我们难以利用这种优势。研究和利用广亲和基因成为扩大杂交水稻杂种优势、解决粮食问题的重要课题。S5位点是影响水稻籼粳杂种胚囊育性的主效位点。本室于2008年克隆了S5位点的ORF5，杨江义通过一系列遗传分析证明了ORF5+是killer，ORF4+是partner，而ORF3+是protector。然而对ORF3、ORF4和ORF5的基因功能和作用途径知之甚少。
　　 ORF3+和ORF3-编码热激蛋白70。ORF3-由于13bp的缺失，导致编码的蛋白-C端最后几个氨基酸差异和提前终止。ORF4+和ORF4-都编码未知蛋白。ORF4+蛋白在-C端有一个跨膜结构域，而ORF4-由于提前终止而缺少跨膜结构域。ORF5+和ORF5-编码的是结构完整的天冬氨酸蛋白酶，而广亲和品种编码的天冬氨酸蛋白酶缺失了信号肽和前肽。
　　 我们在烟草和水稻原生质体中瞬时表达了ORF3+、ORF3-、ORF4+和ORF4-与绿色荧光蛋白融合的蛋白，证明了ORF3+、ORF3-、和ORF4-定位于内质网，而ORF4+定位于细胞膜和高尔基体。我们用免疫电镜的方法探究了ORF5+、ORF5-、和ORF5n的亚细胞定位，结果表明ORF5+和ORF5-位于细胞壁，而ORF5n是一种细胞质内的蛋白。我们还在水稻转基因植株中验证了上述结果，得到了一致的结论。
　　 我们通过研究ORF5-GFP和ORF5-c-myc转基因BY-2悬浮细胞系，发现ORF5的加工依次经过了内质网、高尔基体和反式高尔基体网络等的加工，最后被分泌到细胞外，属于传统的分泌途径。我们还发现ORF5在加工过程中剪切了信号肽和前肽，并且还有少部分序列在加工过程中被去掉，其成熟形式为约37 kDa大小的蛋白。
　　 为了研究ORF4+的蛋白性质，我们建立了ORF4+-GFP转基因BY-2悬浮细胞系和ORF4+-GFP转基因水稻植株。在BY-2细胞中，ORF4+-GFP定位于细胞膜和高尔基体，其所在的细胞器在蛋白转运抑制剂brefeldin A(BFA)处理下发生聚集，而对磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂wortmannin不敏感。ORF4+-GFP标记的细胞器与内吞marker FM4-64部分重合，表明ORF4+处于内吞或循环途径。ORF4+-GFP转基因水稻植株中显示了相同的结果。我们尝试了毕赤酵母表达ORF4+，但是由于表达量过低，没能用亲和纯化的方法得到较纯的ORF4+。
　　 我们对BL、BLORF5+和BL(BL/NJ)的雌配子发生过程进行了切片观察，发现BLORF5+和BL(BL/NJ)呈现了不同的胚囊败育的模式。BLORF5+在减数分裂完成后，珠心细胞就出现异常，后来功能大孢子和珠心细胞都降解。而BL(BL/NJ)中的珠心没有异常。这种败育模式的差异反映了ORF3、ORF4和ORF5的基因型对于孢子体细胞和配子体细胞的影响。
　　 我们通过芯片数据和RNA原位杂交方法研究了ORF3和ORF4的表达模式。结果显示，ORF4和ORF5具有非常相似的表达模式，只在雌蕊表达而在花药中不表达;ORF3在水稻多种组织中表达，但是在雌蕊和花药中表达量最高。
　　 为了研究ORF4+、ORF5+引起胚囊败育，而ORF3+保护胚囊的分子机制，我们比较了功能大孢子时期BLORF5+、BL(NJ/DL)ORF4+以及BL(NJ/NJ)ORF4+的转基因阳性植株与阴性植株胚珠的差异表达基因。结果表明，ORF5+和ORF4+能引起胚珠细胞的内质网胁迫和细胞凋亡相关基因的差异表达;在ORF3+的保护下，内质网胁迫和细胞凋亡相关基因的差异表达很少。我们用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法检测了BLORF5+转基因阳性植株雌配子发生过程的胚珠，发现BLORF5+转基因阳性植株珠心细胞和功能大孢子出现了细胞凋亡。
　　 我们还对BLORF5+转基因阳性植株和BL野生型植株的胚珠进行了胼胝质沉积的检测，发现BL在功能大孢子时期后就没有胼胝质的沉积，而BLORF5+转基因阳性植株的功能大孢子和珠心细胞有胼胝质的沉积。
　　 我们根据遗传分析、分子生物学和细胞生物学的研究，提出了S5位点控制水稻籼粳杂种胚囊育性的“killer-protector”的三基因互作模型，并且证明了ORF5+和ORF4+引起ER stress和PCD，ORF3+缓解ER stress的途径。然而，我们需要更多细节了解这一途径。我们的研究成果对于培育广亲和品种、利用籼粳杂种的杂种优势具有很大的指导意义，将大大提高水稻的产量。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 引言

1．2 生殖隔离研究进展

1．2．1 生殖隔离的基本概念

1．2．2 生殖隔离的基本模型和研究近况

1．3 水稻生殖隔离基因研究进展

1．3．1 亚洲栽培稻的分类和起源

1．3．2 水稻的籼粳杂种不育

1．3．3 水稻籼粳亚种间杂种不育的遗传模型和基因克隆

1．3．4 水稻籼粳杂种胚囊育性基因S5的研究进展

1．4 植物天冬氨酸蛋白酶研究进展

1．4．1 植物天冬氨酸蛋白酶的结构和功能

1．4．2 拟南芥和水稻中天冬氨酸蛋白酶的研究进展

1．5 植物细胞程序性死亡研究进展

1．5．1 植物细胞程序性死亡与抗病反应

1．5．2 植物细胞程序性死亡与植物有性生殖

1．5．3 植物细胞程序性死亡与内质网胁迫

1．5．4 细胞程序性死亡鉴定方法

1．6 植物胼胝质研究进展

1．6．1 胼胝质概述

1．6．2 胼胝质的合成

1．6．3 胼胝质的降解

1．6．4 植物胼胝质的生物学功能

1．7 植物的分泌途径与内吞途径

1．7．1 传统的分泌途径

1．7．2 “非传统的”分泌途径

1．7．3 内吞作用

1．8 植物蛋白质亚细胞定位研究方法

1．9 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 本研究涉及的基因和表述方法

2．1．2 植物材料和细胞系

2．1．3 载体和菌株

2．1．4 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 基因、蛋白质的结构和功能预测、亚细胞定位预测

2．2．2 苏木精整体染色法组织切片

2．2．3 免疫组织化学检测ORF5蛋白的原位表达

2．2．4 免疫电镜实验方法

2．2．5 烟草BY-2细胞原生质体瞬时表达

2．2．6 水稻原生质体瞬时表达

2．2．7 烟草BY-2稳定表达细胞系构建

2．2．8 BFA、wortmannin处理和FM4-64内吞

2．2．9 水稻农杆菌转化

2．2．10 RNA原位杂交方法

2．2．11 TUNEL法检测PCD

2．2．12 荧光染色检测胼胝质沉积

2．2．13 表达谱芯片取样和分析

2．2．14 小样法水稻基因组DNA抽提和转基因植株阳性检测

2．2．15 蛋白抽提，SDS-PAGE和Western Blot

2．2．16 ORF4+的毕赤酵母分泌表达

2．3 载体构建

2．3．1 载体构建时用到的引物

2．3．2 瞬时表达亚细胞定位载体构建

2．3．3 稳定转化BY-2细胞的载体构建

2．3．4 水稻农杆菌转化载体构建

2．3．5 RNA原位杂交探针载体构建

2．3．6 ORF4+酵母表达载体构建

3 结果与分析

3．1 ORF3，ORF4和ORF5的基因差异和蛋白差异

3．2 ORF5蛋白的亚细胞定位

3．2．1 ORF5蛋白在NJ、BL、02428的雌蕊表达

3．2．2 免疫电镜法确定ORF5的亚细胞定位

3．3 ORF5蛋白加工

3．4 ORF3和ORF4蛋白的亚细胞定位

3．4．1 BY-2细胞瞬时表达研究ORF3和ORF4蛋白的亚细胞定位

3．4．2 水稻原生质体系统研究ORF3和ORF4的亚细胞定位

3．5 用水稻转基因植株研究亚细胞定位的尝试

3．6 ORF4+蛋白性质的初步研究

3．7 ORF4+毕赤酵母表达

3．8 BLORF5+与BL(BL／NJ)不同的胚囊败育模式

3．9 ORF3与ORF4的表达模式

3．10 ORF4+与ORF5+表达谱芯片研究

3．10．1 ORF5+表达谱芯片的研究

3．10．2 ORF4+表达谱芯片的研究

3．11 ORF4+与ORF5+引起PCD

3．12 BLORF5+胚珠胼胝质异常积累

4 讨论

4．1 表达模式决定S5位点控制水稻籼粳杂种胚囊育性

4．2 ORF3，ORF4和ORF5可能的生物学功能

4．2．1 ORF3可能的生物学功能

4．2．2 ORF4可能的生物学功能

4．2．3 ORF5可能的生物学功能

4．3 研究展望

参考文献

附录

附录Ⅰ：部分实验操作步骤

Protocol 1：苏木精整体染色法组织切片

Protocol 2：烟草BY-2细胞原生质体瞬时表达

Protocol 3：水稻原生质体瞬时表达

Protocol 4：RNA原位杂交方法

Protocol 5：SDS-PAGE和Western Blot配方

Protocol 6：毕赤酵母表达操作步骤

附录Ⅱ：作者简介

致谢