草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT1和y+LAT2的基因克隆及其mRNA表达研究

摘要

鱼类肠道中氨基酸的运输是由其上皮细胞膜上有着不同功能特性的转运系统完成的，细胞膜上大部分碱性氨基酸的跨膜转运是由转运系统b0,+、y+和y+L完成的，这些系统各自包含了不同的氨基酸转运载体。氨基酸转运载体常常受到日粮组成、肠道的生理状态、发育阶段、激素水平等因素的影响。
　　 鱼类经常受到饥饿胁迫的原因有环境条件变化、食物分布不均及个体差异等。有关草鱼碱性氨基酸转运载体基因的表达对饥饿的响应机制的研究有助于了解其适应饥饿胁迫的生态对策，具有重要的理论意义;该方面的研究对渔业资源管理、苗种培育、养殖生产以及利用补偿生长现象获得经济效益等方面的实践也有重要的指导意义。
　　 本文以草鱼（Ctenopharyngodon idellus）为研究对象，开展了其两个碱性氨基酸转运载体y+LAT1和y+LAT2的克隆，组织表达以及饥饿对其mRNA表达水平的影响等研究工作，为进一步探讨鱼类肠道中氨基酸吸收转运的机制奠定了基础。主要的研究结果如下:
　　 1.y+LAT1和y+LAT2基因cDNA的克隆与分析
　　 y+LAT1基因的cDNA全长序列长2688bp，编码501个氨基酸，GenBank登录序列号为JX013494，y+LAT1蛋白含有与其它脊椎动物y+LAT1相似的结构功能区，包括一个糖基化位点、三个一致的磷酸化蛋白激酶C位点等，它们的氨基酸组成及其位置在不同脊椎动物中高度保守。与其它物种的y+LAT1进行氨基酸序列比对发现，草鱼与斑马鱼的同源性最高，达95.0％。构建y+LAT1蛋白系统进化树与传统形态学分类相一致。对y+LAT2基因进行克隆，得到的cDNA序列片段长1849bp，3’末端序列长478bp，编码456个氨基酸，GenBank登录序列号为KC206055，y+LAT2蛋白含有与其它脊椎动物y+LAT2相似的结构功能区，包括一个糖基化位点、三个一致的磷酸化蛋白激酶C位点等，它们的氨基酸组成及其位置在不同脊椎动物中高度保守。与其它物种的y+LAT2进行氨基酸序列比对发现，草鱼与斑马鱼的同源性最高，达96.5％。构建y+LAT2蛋白系统进化树与传统形态学分类相一致。
　　 2.y+LAT1和y+LAT2基因的组织表达分析
　　 通过荧光定量PCR技术检测了两个碱性氨基酸转运载体基因在草鱼肌肉、脑、鳃、心、肾脏、肝、后肠、中肠、前肠、脾脏中的表达情况。研究结果显示，草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT1 mRNA在中肠表达量最高(p＜0.05)，前肠和脾脏次之，其它组织表达量从高到低依次为肾脏、后肠、鳃、心脏、肝脏、肌肉和脑;草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2 mRNA在前肠表达量最高(p＜0.05)，其次是脾脏，而中肠、肾脏、心脏和肌肉的表达量次之，其它组织表达量从高到低依次为肝脏、后肠、鳃和脑。
　　 3.饥饿对草鱼y+LAT1和y+LAT2 mRNA表达水平的影响
　　 利用荧光定量PCR技术检测了饥饿14d后草鱼脾脏、肾脏、前肠和中肠中y+LAT1和y+LAT2 mRNA表达量的变化。结果表明，前肠和中肠中y+LAT1基因mRNA的表达量在饥饿1d后其表达量是下降的，随后在中肠中其表达量是逐渐升高的，但在前肠中其表达量的升高没有明显的规律。脾脏和肾脏中y+LAT1基因mRNA的表达量与前肠和中肠中是不一致的，都是降低的，饥饿的14 d期间肾脏中其表达量是逐渐降低的，脾脏中其表达量是降低的同时保持较低的水平(p＞0.05)。脾脏和肾脏中y+LAT2基因mRNA的表达量分别在饥饿2d和3d达到最低，随着时间的延长其表达量无规律性。前肠和中肠中y+LAT2基因mRNA的表达量与脾脏和肾脏中是不一致的，在饥饿0d和5d之间均呈下降趋势，在饥饿7d时显著上调(p＜0.05)并达到峰值。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

1．碱性氨基酸转运载体y+LAT1研究进展

1．1 y+LAT1的结构和分布

1．2 y+LAT1基因

1．3 y+LAT1的功能特征

2．碱性氨基酸转运载体y+LAT2研究进展

2．1 y+LAT2的结构和分布

2．2 y+LAT2基因及y+LAT2的功能

3．饥饿对鱼类的影响

3．1 饥饿对鱼类组织结构及其生长的影响

3．2 饥饿对鱼类血液生理生化指标的影响

3．3 饥饿对鱼类代谢水平的影响

3．4 饥饿对鱼类存活率的影响

3．5 饥饿对鱼类基因表达的影响

4．本研究的目的及意义

5．本研究的技术路线

第一章 草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT1和y+LAT2基因克隆及生物信息学分析

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 总RNA提取及y+LAT1基因中间片段的克隆

2．2 y+LAT1和y+LAT2末端序列的克隆

2．3 生物信息学分析

3 讨论

3．1 y+LAT1基因cDNA的特性

3．2 y+LAT2基因cDNA的特性

第二章 草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT1和y+LAT2基因组织表达分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 特异性引物的筛选

2．2 草鱼y+LAT1基因的组织特异性表达

2．3 草鱼y+LAT2基因的组织特异性表达

3 讨论

3．1 荧光定量PCR讨论

3．2 y+LAT1和y+LAT2 mRNA的组织分布

第三章 饥饿对草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT1和y+LAT2 mRNA表达的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验试剂

1．3 实验方法

1．4 数据分析

2 结果与分析

2．1 饥饿对草鱼y+LAT1 mRNA表达的影响

2．2 饥饿对草鱼y+LAT2 mRNA表达的影响

3 讨论

结语

1．结论

2．创新点

参考文献

附录：攻读学位期间发表论文情况

致谢