人异常胎盘转录组分析及MAGEL2基因在猪胚胎中的印记研究

摘要

宫内发育迟缓和先兆子痫致病因素多样，病情表现各异，目前关于它们的具体病理原因还不确定，但溯其根源，这两种妊娠异常疾病都是由于胎盘机能不全造成的。目前已有一些报道的胎盘特异性生物化学标记可用于鉴定先兆子痫，但这方面的信息还不全面，可用于临床的生物标记很少;而对于宫内发育迟缓，由于该疾病病理的高异质性、多样性，以及与其他疾病同时发生等原因，传统的临床分类很难体现真实的病理分类信息，从而导致从基因组水平研究该疾病的分子机理存在一定困难。另一方面，microRNA作为重要的基因表达调控元件，广泛参与到很多胎盘发育相关的生物过程中（如细胞分化、增殖、凋亡、侵入及血管生成等），同时也可作为循环系统中稳定的生物标记。因此，本研究的目的是揭示人类胎盘的转录组，分析先兆子痫和宫内发育迟缓中特异性的差异表达基因，根据差异表达基因筛选差异表达的microRNAs，作为预测先兆子痫和宫内发育迟缓的分子标记。为了实现此目的，本研究采用IlluminaHuman6.0BeadArray对86个人类胎盘样品的转录组展开研究，并综合运用可调模块性聚类分析（ModulatedModularityClustering，MMC）和基因集合富集分析(GeneSetsEnrichmentAnalysis，GSEA)预测差异表达microRNAs，然后利用实时定量PCR验证候选microRNAs在胎盘中的差异表达并构建预测异常妊娠的决定树，最后研究了microRNA作为分子标记在母体血浆中的稳定性。主要结果如下:
　　 (1)根据原始临床分类信息，从先兆子痫中鉴定到128个基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上表达差异显著，2109个基因在FDR＜0.05水平上表达差异显著;而在宫内发育迟缓胎盘中，仅能鉴定到1个基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上差异显著，26个基因在FDR＜0.05水平上差异显著，说明宫内发育迟缓样品存在高异质性。
　　 (2)通过可调模块性聚类分析(MMC)，鉴定到两个分别代表宫内发育迟缓(IUGR)和先兆子痫(PE)的模块，它们分别是模块3和模块5。其中模块3仅由IUGR胎盘组成，模块5由11个PE和7个IUGR胎盘共同组成，且其中7个IUGR胎盘中有4个同时被诊断为PE，由此可以看出，模块3代表IUGR，而模块5代表PE。
　　 (3)根据由MMC获得的新分组信息进行差异表达基因分析，从代表先兆子痫的模块5中鉴定到889个基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上表达差异显著，5184个基因在FDR＜0.05水平上表达差异显著;而从代表宫内发育迟缓的模块3中鉴定到326个基因在保守的Bonferronip＜0.05水平上表达差异显著，2100个基因在FDR＜0.05水平上表达差异显著。
　　 (4)将异常胎盘内差异表达基因进行通路分析，获得的通路主要与细胞生长、分化及发育相关。由模块3中差异表达基因富集到的通路主要包括P13K、AKT、mTOR、eIF4、p70S6K信号通路，细胞凋亡信号通路，和IGF-1信号通路;由模块5中差异表达基因富集到的通路包括EIF2信号通路、RhoGDI信号通路，mTOR信号通路，以及与免疫反应相关的通路，如白细胞外渗信号通路、Fcg受体介导的巨噬细胞和单核细胞吞噬通路，以及CXCR4信号通路。
　　 (5)根据异常胎盘内差异表达的分子标签，基因集合富集分析(GSEA)预测了差异表达的候选microRNA，选择其中六个最显著的microRNA(miR-520A-5p，miR-194，miR-412，miR-149，miR-483，miR-503)作为候选分子标记。实时定量PCR结果显示，miR-194在先兆子痫(p=0.0001)和宫内发育迟缓(p=0.0304)胎盘中的表达水平都显著下降，miR-149在先兆子痫(p=0.0168)中表达水平显著下降。
　　 (6)根据6个候选microRNA在71个胎盘中的表达水平，分别构建了预测先兆子痫和宫内发育迟缓的决定树。根据排列置换检测，所得决定树均在统计学上意义显著(p＜0.05)。
　　 (7)三个广泛表达的miRNAs（miR-16，miR-15，miR-24）在血浆中的水平保持恒定，不受室温及反复冻融次数的影响;本研究中的差异表达miRNAs(miR-149，miR-194)在母本血浆中同样非常稳定，不受室温及反复冻融次数的影响。说明组织释放的microRNA稳定地存在于外周循环血液中。
　　 另一方面，由于印记基因对哺乳动物胚胎发育和出生后的生长发育都有重要作用，在人异常胎盘的转录组中发现很多印记基因的表达受到影响，而且影响家畜数量性状的一些基因同时存在印记现象，因此本研究另一目的是以猪为模式动物，研究候选印记基因MAGEL2在两个胚胎时期中的印记状态以及该基因多态位点与猪胴体性状的关联分析。主要结果如下:
　　 (1)猪MAGEL2基因与其人和小鼠中的同源基因一样，为无内含子基因。该基因主要在65日龄胚胎的脑、胎盘中高表达，其次是心脏，而在脾、肺、肾、胃、小肠和肌肉中的表达水平偏低，在肝中的表达水平最微弱。
　　 (2)猪MAGEL2基因在65日龄胚胎所有被检测组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、脑、胎盘）中均母本印记、父本表达，而在30日龄胚胎中存在印记多态性，即16个杂合子胚胎中有2个胚胎逃脱印记，说明在胚胎早期发育阶段稳定的印记还未建立完善。
　　 (3)大白×梅山F2代资源家系中的关联分析结果显示，猪MAGEL2基因的多态位点g.2592A＞C与屠宰率和臀部背膘厚显著相关(p＜0.05)，g.3277T＞C与骨率显著相关(p＜0.05)，他们可能成为猪育种的重要遗传标记。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1 研究问题的由来

2 宫内发育迟缓(IUGR)与胎儿小于妊娠年龄(SGA)

2．1 宫内发育迟缓概述

2．2 宫内发育迟缓的高危因素

2．3 宫内发育迟缓的预测

3 先兆子痫(PE)

3．1 先兆子痫概述

3．2 先兆子痫的病理生理学

3．3 利用生物标记检测先兆子痫的必要性

3．4 先兆子痫相关的生化标记

3．5 鉴定新的生物标记

4 microRNA与怀孕过程

4．1 microRNA概述

4．2 microRNA的生物合成和RNA干扰途径

4．3 胚胎着床期的microRNA

4．4 microRNA在胎盘中的表达

4．5 microRNA在调节母体-胎台儿免疫耐受中的作用

4．6 母体外周循环血中与妊娠相关的microRNA

5 微阵列基因芯片技术及其应用

5．1 微阵列基因芯片概述

5．2 基因芯片在繁殖医学上的应用

5．3 微阵列基因芯片技术的未来

6 基因组印记

6．1 基因组印记概况

6．2 基因组印记的表达调控

6．3 基因组印记与家畜数量性状

6．4 候选基因MAGEL2概述

7 研究目的与意义

第二章 人先兆子痫和宫内发育迟缓胎盘转录组分析及差异表达microRNA研究

1 背景介绍

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 研究群体人口普查信息统计

3．2 方差主成分分析及线性混合模型的选择

3．3 人胎盘转录组比较分析

3．4 根据胎盘转录组进行可调模块性聚类分析(MMC)

3．5 根据基因集合富集分析(GSEA)预测候选microRNAs

3．6 Real-time qRT-PCR验证候选microRNAs在人胎盘中的差异表达

3．7 根据候选microRNAs在胎盘中的表达水平构建决定树

3．8 microRNA在母本外周循环血液中的稳定性研究

3．9 人胎盘差异表达基因相关的IPA通路

4 讨论

4．1 群体的个体差异对基因表达情况的影响

4．2 宫内发育迟缓(IUGR)样品的高异质性

4．3 可调模块性聚类分析(MMC)的引入及聚类方法的选择

4．4 可调模块性聚类分析(MMC)结果的有效性

4．5 宫内发育迟缓(IUGR)相关的因子和通路

4．6 差异表达microRNA的目标靶基因

4．7 决定树的预测准确性

5 本章总结

5．1 总结及意义

5．2 创新点

5．3 下一步工作计划

第三章 以猪为模式动物研究印记基因MAGEL2在两个胚胎时期的印记状态及与胴体性状的关联分析

1 背景介绍

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 猪MAGEL2基因的克隆测序结果

3．2 猪MAGEL2基因在猪胚胎中的组织表达谱

3．3 猪MAGEL2基因的SNP鉴定结果

3．4 猪MAGEL2的等位基因频率及基因型频率

3．5 猪MAGEL2基因在猪30日龄和65日龄胚胎中的印记状况

3．6 猪MAGEL2基因与胴体性状的关联分析

4 讨论

4．1 模型的建立和发育时期的选择

4．2 MAGEL2在人、小鼠、猪中的表达和印记情况

4．3 猪MAGEL2基因的印记多态性

4．4 印记基因对母体-胎儿互作的影响

4．5 印记基因对胎儿出生后行为的影响

4．6 关联分析的不足之处

5 本章总结

5．1 总结及意义

5．2 创新点

5．3 下一步工作计划

参考文献

附录1：补充表格

附录2：芯片数据分析相关代码

博士在读期间研究成果

致谢