高温胁迫下棉花花药发育表达谱分析及GhCKI基因功能鉴定

摘要

全球气候变暖带来的频繁高温天气导致农作物雄性败育是影响作物产量的主要因素之一。本研究通过对棉花耐高温材料和不耐高温材料在高温处理前后花药不同发育时期取样后进行表达谱测序。通过差异表达基因筛选、鉴定和分析，确定了一批参与花药响应高温胁迫的重要候选基因。并对其中一个编码 I型的酪蛋白激酶的候选基因GhCKI进行了功能鉴定。本研究取得的主要结果如下：
　　1、细胞学分析发现正常温度（28-35℃/20-28℃ day/night）和高温条件下（35-39℃/29-31℃ day/night）两个陆地棉品系（‘84021’，高温耐受型；‘H05’，高温敏感型）的花药发育存在明显区别。高温胁迫下‘84021’的花药发育基本不受影响，但‘H05’的花药发育进程延缓，花药不开裂是其花药败育的典型细胞学特征。利用 RNA-Seq测序技术对正常温度和高温条件下两个材料的三个花药发育关键时期（四分体时期、绒毡层降解期、花药开裂期）共十二个样品进行全基因组表达谱分析。共获得5194个在棉花花药发育过程中参与高温胁迫响应的差异表达基因，其中4599个基因在两个棉花品系不同花药发育时期受高温诱导后表达趋势不同。这些差异表达的基因主要富集于基因表达调控、代谢及胁迫响应的KEGG信号途径，包括染色体的修饰、碳水化合物的代谢、植物激素信号和内质网胁迫路径等；进一步分析表明高温敏感材料‘H05’花药中DNA甲基化和组蛋白修饰相关基因的变化极为显著，这与‘H05’花药在高温胁迫下差异表达的基因更多（4004个）相一致。基因表达分析表明参与糖代谢、内质网胁迫响应、生长素代谢与信号路径的基因在高温胁迫下的两个材料间具有明显不同的差异表达模式；相应的酶活（如淀粉合成相关酶：AGPase、SSSase、GBSSase；活性氧清除相关酶：超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD））及其相关代谢产物（淀粉，蔗糖，葡萄糖，可溶性蛋白和过氧化氢）含量测定的结果表明，高温胁迫导致‘H05’花药中糖代谢紊乱、内质网胁迫严重。同时我们还发现在高温胁迫前后‘84021’和‘H05’的花药不同发育时期生长素含量存在明显区别，‘H05’花药中生长素的含量显著高于‘84021’，这与生长素代谢相关基因的表达变化相吻合。在高温处理前，外源施加生长素时会引起‘84021’花药的部分败育，暗示本底高浓度的生长素含量可能使花药发育对高温胁迫更敏感。
　　2、为了进一步了解棉花花药响应高温胁迫的分子机制，我们从表达谱的差异表达基因中选择了GhCKI基因进行系统的功能研究。序列分析显示GhCKI编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与动物及酵母中 I型酪蛋白激酶具有较高的同源性。PGhCKI:GUS的精细表达模式分析显示GhCKI在温敏材料‘H05’的花药绒毡层细胞和小孢子中受高温诱导特异表达。研究发现GhCKI在拟南芥中超量表达能使部分转基因株系的花药败育，qRT-PCR、Western Blotting及酶活分析结果显示GhCKI引起花药败育具有剂量效应。组织切片和细胞学观察发现GhCKI在拟南芥中超量表达引起花药败育可能是由于绒毡层 PCD延迟导致花粉发育延缓和花药不开裂。RNA原位杂交实验证明GhCKI在转基因拟南芥的花药绒毡层细胞和小孢子中高量表达，这与高温胁迫下‘H05’花药中GhCKI的诱导表达部位一致。为了进一步探讨GhCKI超量表达引起花药败育的机制，我们利用基因芯片对转基因拟南芥的花药发育进行了表达谱分析。分析结果显示转基因拟南芥花药中碳水化合物代谢，ABA合成和代谢，ROS的产生和清除等路径受到明显影响。酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补实验（BiFC）证实GhCKI能与淀粉合成酶互作并能抑制其活性导致葡萄糖在花药发育的早期特异积累。花药早期特异积累的葡萄糖能反馈抑制葡萄糖的吸收和诱导淀粉合成，并导致在花药发育后期葡萄糖缺乏。这与棉花品系‘H05’花药在高温胁迫下花药发育过程中葡萄糖含量变化相类似。此外还发现GhCKI超量表达引起早期花药中ABA和ROS的过量积累和相关代谢平衡失调。GhCKI的超量表达引起后期花药中ROS被过度清除，是导致花药绒毡层PCD延迟和花药败育的原因。本研究丰富了棉花花药遭受高温胁迫后的响应机制，为棉花耐高温研究提供基因资源及理论基础，同时也为认识棉花雄性不育的分子机理提供了依据。
　　3、研究中还发现 GhCKI参与了棉花众多生长发育和生理过程。初步结果显示GhCKI超量表达能抑制棉花体细胞胚胎发生，表明其参与了棉花体胚发生的调控，可能与细胞的无性增殖和分化有关。这与动物中CKI参与Wnt路径调控细胞增殖与分化相似。此外还发现GhCKI在纤维发育的早期高效表达，GhCKI沉默的转基因棉花纤维发育受到明显影响。但其作用机制还有待进一步的研究。

目录

声明

缩略语表

1 前言

1.1植物高温胁迫反应

1.2 高温胁迫影响植物雄性生殖器官发育调控

1.3植物雄性生殖器官发育调控

1.4 I型酪蛋白激酶研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 高温胁迫下棉花花药发育表达谱分析

3.2 GhCKI基因功能分析I-影响雄性生殖器官发育

3.3 GhCKI基因功能分析II-GhCKI参与调控棉花体细胞胚胎发生

3.4 GhCKI基因功能分析III-影响纤维发育

4 讨论

4.1 高温胁迫下棉花花药发育表达谱分析

4.2 棉花花药表达谱中分离的GhCKI影响雄性生殖器官发育

4.3 展望

参考文献

附表1

附表2

在读期间已发表和待发表论文

申请专利

致谢