小麦筛分子发育过程中的编程性细胞半死亡机理研究

摘要

小麦颖果腹部韧皮部筛分子的主要功能是将光合同化物向颖果胚乳转运并贮存在胚乳中。筛分子的发育经历了细胞核和细胞质（包括核糖体、内质网、部分线粒体和高尔基体和液泡等）的降解（保留了完整的细胞膜、少量细胞质），最后形成成熟的有活性的筛分子，进而履行运输有机物质的功能。已有研究证实筛分子发育经历了一个类似细胞编程性死亡(PCD)的过程，但该过程又有不同的特征，故将其取名为细胞编程性半死亡。筛分子编程性半死亡机理目前没有明确的结论，还有许多问题亟待解决，如筛分子分化时细胞质是怎样被降解的，与液泡是否相关？筛分子分化时细胞内pH值如何变化，如何影响酸性蛋白酶活性？细胞编程性死亡过程会停止，是否有植物体自身进化的蛋白酶抑制子起作用？为了解决上述问题，本研究采用多种技术手段，如植物显微技术、免疫组织和超微细胞定位技术和分子生物学技术等开展研究。主要得到如下结论:
　　 1.筛分子发育的超微结构上具有以下几个特征。
　　 (1)核染色质在细胞核内降解，细胞核没有出现分裂。核膜在染色质降解完全后仍然保持完整的双层结构，但是核孔间距增大。细胞核降解完成后，液泡结构仍然是完整的。
　　 (2)筛分子分化开始时，少量细胞质被降解，花后4.5d时则有大量细胞质被降解。而细胞质主要是通过液泡膜内陷进入液泡中，然后被液泡里的水解酶降解，这种液泡降解细胞质的方式被称为微自噬。
　　 (3)花后5d和6d，大量细胞质被降解后，部分液泡膜与质膜融合，部分液泡膜破裂。液泡膜和质膜的融合使得其融合区间包含了部分细胞质，而液泡膜破裂也使得液泡里的水解酶等物质与液泡外其他细胞质互相混合。
　　 (4)花后0d和1d筛分子里内质网断裂成短片段。内质网片段腔不断扩大，并且其始终围绕小液泡排列，甚至有些内质网末端还会与液泡膜断裂处相连。
　　 2.利用氢离子荧光探针检测不同发育阶段的筛分子内酸性环境变化，结果显示筛分子仅在花后5d显现出极微弱的黄绿色荧光，其他天数内筛分子都显示蓝色荧光。同时果皮和花后1d的导管出现明亮的黄绿色荧光。根据荧光颜色，以导管和果皮的酸性变化作为参照，发现筛分子在花后5d细胞内发生微弱酸性变化。
　　 3.小麦天冬氨酸蛋白酶(WAP1)的免疫组织定位显示，在筛分子分化过程中WAP1表达量先增加后减少至不表达，花后5d时达到最大。WAP1的免疫超微定位显示，WAP1主要在筛分子液泡里出现;液泡膜部分破裂后，均匀地分布在筛分子里。WAP1的mRNA原位杂交结果显示，WAP1mRNA在花后2d的维管束里转录量最大，随后逐渐减少。mRNA仅在维管束的部分细胞中转录，这部分细胞体积大，可能是伴胞。
　　 4.CystatinsmRNA的原位杂交结果显示，仅少量cystatinsmRNA在花后4d的腹部维管束里转录，紧临导管的薄壁细胞里转录量较多。其中，cystatinsmRNA还在小麦幼苗种子根筛分子里特异性转录。
　　 5.组织水平原位检测蛋白酶B活性的结果显示，花后2d筛分子组织蛋白酶B活性开始出现，当活性达到最强后又逐渐减弱。根据荧光强度判定，花后4d的筛分子里组织蛋白酶B活性最强。另外，组织蛋白酶B活性也出现在发育的根尖筛分子里。
　　 上述结果证实，筛分子编程性半死亡中的细胞质降解主要是由液泡介导的微自噬过程。待液泡里的细胞质基本降解完全后，液泡膜选择性的与质膜融合（融合的区间包含少量细胞质，使得部分细胞质得以保留），而且在膜融合的时候出现细胞质弱酸化。同时，WAP1和组蛋白酶B活性类似的蛋白酶调节筛分子发育，导致其编程性半死亡发生。组蛋白酶B活性类似的蛋白酶在筛分子细胞质大量降解前活性最强，可能参与筛分子活性的维持，而WAP1的作用则相反，主要降解筛分子细胞质。因此，筛分子发生编程性半死亡的发生可能是由液泡和多种蛋白酶共同作用的结果。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 筛分子发育的研究进展

1．1．1 筛分子分类

1．1．2 筛分子结构和分化特征

1．2 细胞编程性死亡研究进展

1．2．1 细胞编程性死亡在动物中的分类

1．2．2 植物中PCD的2大类型

1．2．3 动物和植物中PCD分类的比较

1．2．4 动物和植物中编程性死亡的机理

1．3 筛分子编程性半死亡机理研究

1．3．1 酸化

1．3．2 液泡变化和蛋白酶

1．3．3 半胱氨酸蛋白酶抑制因子

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料培养

2．2 方法

2．2．1 小麦颖果体视观察和取材方法

2．2．2 小麦颖果腹部筛分子和根尖组织结构光镜观察

2．2．3 超微结构观察

2．2．4 酸性变化检测

2．2．5 WAP1的免疫组织和超微定位

2．2．6 WAP1 mRNA和cystatins mRNA原位杂交

2．2．7 组织蛋白酶B(cathepsin B)活性在根尖和腹部筛分子的原位检测

3 结果与分析

3．1 颖果腹部韧皮部维管束位置

3．2 筛分子超微结构变化

3．2．1 筛分子里内质网与液泡的关系

3．2．2 筛分子里核膜的变化

3．2．3 筛分子里液泡的变化

3．3 腹部维管束筛分子酸性变化

3．4 WAP1免疫组织和亚细胞定位

3．5 WAP1 mRNA原位组织杂交结果

3．6 WCs mRNA原位组织杂交结果

3．7 组织蛋白酶B活性在颖果腹部筛分子里的变化

3．8 小麦根尖结构和筛分子分裂分化位置

3．9 WCs mRNA在根尖筛分子的原位组织杂交结果

3．10 组织蛋白酶B活性在小麦根尖组织结构里的变化

4 讨论

4．1 韧皮部筛分子的结构与功能的一致性

4．2 小液泡可能起源于内质网

4．3 筛分子分化时细胞核和部分细胞质的降解

4．3．1 筛分子分化过程中细胞核降解方式

4．3．2 筛分子分化时细胞质的降解与液泡的关系

4．4 筛分子分化的细胞编程性死亡分类

4．5 筛分子分化时细胞质酸性变化

4．6 液泡酸性水解酶(WAP1)和组蛋白酶B活性类似蛋白酶共同调控筛分子编程性半死亡

4．7 筛分子分化时半胱氨酸蛋白酶抑制子的功能

4．8 根部筛分子结构

4．9 根尖筛分子分化时组织蛋白酶类和半胱氨酸蛋白酶抑制子功能

4．10 小麦颖果腹部筛分子和根尖筛分子分化的区别

参考文献

附录1 论文图版

附录2 在读期间发表和拟发表的文章

致谢