硫化叶菌启动子Initiator元件功能研究

摘要

在真核生物中Initiator(Inr)对启动子活性的重要性已经建立，且属性研究的比较完善，它是位于转录起始位点区域的一个单向核心启动子元件，在含有TATA-box的启动子中巩固启动子强度，而在不含有TATA-box的启动子中定位转录起始位点和转录方向。然而古菌的研究起步较晚，遗传体系和遗传操作并不如真核细胞发展的成熟，过去在古菌的TATA和Inr之间插入或删除DNA序列，转录起始仍能有效进行，因此人们认为Inr在古菌中并不重要。仅有的两篇古菌Inr的报导只显示转录起始位点区域的突变会降低启动子强度并影响转录起始位点的选择，目前古菌Inr的具体属性并没有被深入研究，比如Inr的位置、长度、序列偏好性、保守性。
　　古菌是真核生物在DNA复制、修复、转录和翻译方面的简化版，故人们研究古菌不仅更了解其本身，也为了解真核细胞提供了模型和进化上的参考。Kimberly B.Decker和Deborah M.Hinton发现细菌、古菌和真核生物的RNA合成中心在结构和功能上相似，启动子模块从细菌到人类普遍保守，细菌、古菌和真核生物在核心启动子内和靠近核心启动子区域的调控策略相似，都会采取不同的核心启动子元件的组合。真核Inr是启动子结构多样性贡献于转录调控多样性的代表性元件，本文对古菌Inr的研究不仅有助于了解古菌启动子结构和转录起始机制，也将对古菌核心启动子水平的转录调控有更深入的认识。
　　得益于本课题组近年发展起来的Sulfolobus遗传操作体系，包括有效的pyrEF营养缺陷型筛选和基于lacS的颜色筛选，以及E.coli-Sulfolobus穿梭质粒pZC1，我们可以用重叠延伸PCR和反向PCR构建多种Inr突变启动子，将这些Inr突变启动子和报告基因lacS融合插入pZC1，以Sulfolobus islandicus E233S pyrEF/lacS双突变菌株作为宿主，得到相应的转化子。比较各个转化子的lacS比活性，根据lacS酶活性的变化确定突变对表达的影响，并采用RT-qPCR和引物延伸实验确定突变对转录的影响，然后计算翻译水平的影响。
　　硫化叶菌阿拉伯糖操纵子有4个基因araS(Arabinose binding protein)，araT和araU(Permease)还有araV(ATPase)，本课题组对araS启动子的研究有一定的基础，araS Inr成为我们的首要研究对象，启动子+1到+6突变对酶活有剧烈影响支持了此处含有Inr的假设，进一步的引物延伸和RT-qPCR证实这是一个影响转录的元件，而对翻译的影响有限。在无ara-box的启动子T6BRE的基础上突变Inr，酶活下降为D-55的2.1％，基本失去活性，这说明Inr并不止在受诱导的araS启动子中才起作用，而是基础启动子发挥活性所必须的基本启动子元件。在T6BRE的基础上突变TATA-box，酶活完全丧失，说明Inr对启动子的贡献依赖于TATA-box。araS Inr的系统突变发现在araS启动子中天然Inr功能最强，序列偏好性可以总结为+1GAKAMY+6(IUPAC，K=G或T;M=A或C;Y=T或C)，这可以帮助我们鉴别潜在的Inr和转录起始位点，也是寻找Inr结合蛋白的必要信息。
　　另一方面生物信息学方法被用来分析S.solfataricus P2487个基因的保守Inr序列，配合体内实验得到的碱基偏好性对比分析。S.solfataricus P2生物信息学比对得出的-1YRWKAAA+6的保守序列与araS Inr非常相似，分类比对发现Inr倾向存在于UTR≥4的基因中，不同功能基因的比对发现Inr在能量代谢基因中非常保守。序列比对证明不是所有基因都含有Inr，这和S.islandicus中体内实验结果相对应，同样受阿拉伯糖调控的SiRe0562、SiRe2130、SiRe2129和SiRe2125并不含有Inr。但突变含有Inr的基因，不论是araS还是随机选择的Sso1934、Sso3180和Sso1171，酶活都显著降低。
　　把araS Inr插入无Inr基因SiRe0562、sso0009和sso1029的启动子中，它们的表达得到了增强。细胞对有和没有Inr的基因进行差异调控，这可能基于TFB和RNA聚合酶与Inr的结合，这种机制与σ家族介导的细菌转录调控和Halophile中GTFs组合参与的全局调控相似。Sulfolobus只编码一个TBP和两个有功能的TFBs，TFB或RNA聚合酶与Inr亲和度的差异正好可以弥补有限的GTFs，增加转录调控的可能。
　　总的来说，本研究通过体内实验和生物信息学分析鉴定到古菌中保守的Inr,发现Inr对转录很重要，且Inr倾向存在于UTR≥4的能量代谢类基因中，在没有Inr的启动子中插入Inr增强了转录。据我们所知，这是第一次对古菌Inr进行的深入探讨，完善了对古菌启动子的认识。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 古菌简介

1．1．1 三域分类系统

1．1．2 古菌的主要特征

1．1．3 古菌的主要类群

1．2 硫化叶菌及其遗传操作体系

1．3 细菌古菌和真核生物转录的比较

1．3．1 细菌的转录

1．3．2 真核生物的转录

1．3．3 古菌的转录

1．4 细菌古菌和真核生物的启动子

1．5 真核生物和古菌的起始子

1．5．1 真核生物的起始子

1．5．2 真核生物起始子的作用机制

1．5．3 古菌的起始子

1．6 启动子结构多样性在转录调控中的作用

1．7 本研究的主要内容和意义

2 材料与方法

2．1 菌株和质粒

2．2 培养基配方及培养条件

2．3 主要分子生物学试剂

2．4 实验方法

2．4．1 大肠杆菌DH5α热击转化法

2．4．2 硫化叶菌感受态的制备

2．4．3 硫化叶菌的电转化

2．4．4 硫化叶菌总DNA的提取

2．4．5 硫化叶菌总RNA的提取

2．4．6 β-galactosidase(LacS)酶活测定

2．4．7 重叠延伸PCR

2．4．8 系统突变

2．4．9 反转录实验

2．4．10 实时荧光定量PCR

2．4．11 引物延伸实验

2．4．12 生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 Inr的发现

3．1．1 araS启动子上鉴定到新的启动子元件

3．1．2 Inr的突变影响转录效率

3．1．3 Inr并不存在于所有启动子中

3．2 Inr的属性

3．2．1 Inr是基础转录必需的且依赖于TATA-box

3．2．2 Inr的碱基偏好性

3．3 Inr激活转录

3．3．1 Inr对SiRe0562的激活

3．3．2 Inr对Sso0009和Sso1029的激活

3．4 Inr的生物信息学分析

3．4．1 不同5’UTR长度基因的分类比对

3．4．2 不同功能基因的分类比对

3．4．3 保守Inr基因的Inr对转录很重要

4 讨论

4．1 Inr是一个重要的基础启动子元件

4．2 哪个蛋白质与Inr结合

4．3 Inr对启动子结构多样性的贡献

4．4 Inr作为转录激活序列

参考文献

附录

博士期间学术成果

致谢