一例鸡禽霍乱的诊断及防治失败原因浅析

摘要

禽霍乱（Fowl cholera）是由禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）所引起的禽类的一种分布广泛的接触性传染病。近年来从临床病例中分离的Pm菌株多表现为强致病力和多重耐药的特性，给我国基层养殖户和养禽企业造成较大的经济损失。目前主要采取依赖抗生素防治的方式，不仅疗效甚微，而且影响食品安全。灭活疫苗和传统弱毒疫苗在控制该病的发生中发挥重要作用，但临床流行的多血清型菌株限制了传统疫苗的使用效果。因此开发可预防多种血清型感染的基因工程弱毒疫苗是防治该病的理想策略，但受到遗传操作工具的限制。本研究对广西某鸡场发生的鸡急性死亡病例进行诊断，并评估、统计抗生素对鸡场疫病的防控效果，以分离的禽多杀性巴氏杆菌 GX-Pm为主要研究对象，对其基因组进行测序，掌握其多重耐药的原因以及重要的毒力基因。并以此为基础，开展敲除重要毒力基因的研究。以期建立一种简单、有效的Pm基因敲除遗传操作系统，为禽霍乱的基因缺失弱毒疫苗研制和免疫防控奠定基础。本研究的主要结果如下：
　　1.一例鸡禽霍乱的临床和实验室诊断
　　对广西某鸡场发生的急性死亡病例进行了诊断，病鸡临床表现为无前驱症状、突然发病、迅速死亡；病理剖检发现病死鸡心包有大量黄色浸出液，肝脏大量分布针头大小的灰白色坏死点，分离菌经瑞氏染色呈典型的两极浓染，为多杀性巴氏杆菌，命名为GX-Pm。结合临床和实验室诊断结果，确诊鸡场发生的疾病是禽霍乱。
　　2.分离菌株GX-Pm的基因组分析
　　利用Illumina MiSeq测定了GX-Pm的全基因组序列，其基因组大小为2.29Mb。通过基因注释，发现了与荚膜、脂多糖等毒力相关基因和代谢途径。预测到5个基因组岛，4个插入序列，2个噬菌体相关的基因编码区域，2个CRISPRs结构区域。推测基因组岛、插入序列以及噬菌体相关基因编码区域的存在是导致 GX-Pm具有强致病能力的原因之一。分析发现2个链霉素抗性基因，1个氯霉素抗性基因以及1个磺胺抗性基因均包含在基因组岛内。因而存在于GX-Pm基因组内的基因组岛也是导致其具有多重耐药性的重要原因。分析认为，获得水平转移元件可能是目前产生多重耐药性和毒力增强的重要原因，获得了该菌毒力相关基因的编码序列为开展基因敲除研究进而构建基因缺失弱毒疫苗用于免疫防控禽霍乱奠定了重要基础。
　　3.鸡场防治禽霍乱失败的原因分析
　　该发病鸡场此前没有制定合理科学的免疫程序，日常疾病的防控主要依耐抗生素的使用。没有进行疫苗接种的鸡群免疫力水平低，容易感染病原微生物而发病。再加上抗生素的长期使用导致了病原菌出现严重的耐药性，给防控带来很大困难。抗生素的使用无法取得较好的防控效果。周边鸡场尽管此前接种过灭活疫苗，然而免疫效果不佳。开发新型疫苗用于禽霍乱的免疫防控显得非常重要和迫切。
　　4. Pm基因缺失弱毒株的构建
　　为研制新型禽霍乱疫苗，本研究以aroA、hyaE及pfhB2基因为靶基因，首先应用温敏质粒pSHK3TS进行Pm的基因敲除，发现其转化效率高，但只表现出部分温敏特性，未能成功获得基因敲除菌株。采用不能在Pm中复制的pBC-Ka质粒结合负筛选标记SacB进行突变体筛选，发现pBC-Ka-SacB质粒在Pm的转化效率较低，获得的单交换菌株在无抗生素的培养条件下，很容易发生回复突变，也未能获得基因缺失突变株。分析原因可能是突变体生存能力较野生菌低，容易被野生菌所覆盖从而得不到突变体。为解决该问题，应用抗生素抗性基因替换目的基因，使用正向筛选同源重组的方法进行突变体的筛选。使用pBC-Ka-Erm质粒，构建了在aroA基因ORF内缺失了312bp区域，并插入了红霉素（Erm）基因的aroA基因缺失突变株，生物学特性研究发现其表现出aroA基因缺失突变株的特征，致病性研究发现其致病性进一步下降。本研究为Pm基因缺失弱毒疫苗株的构建奠定了重要基础。
　　本研究对某鸡场发生的急性死亡病例进行了诊断，分析了其发病及防治失败的可能原因。以临床分离的 GX-Pm株为研究对象，测定了其基因组序列并分析发现基因组岛携带的毒力相关基因和耐药基因可能是其产生多重耐药性和毒力增强的重要原因。以获得的毒力基因序列为基础，应用Pm基因敲除工具进行弱毒疫苗株的构建，发现现有工具效率低，需要改良，并成功构建了 aroA基因缺失突变株，其毒力进一步降低。本研究为鸡禽霍乱的诊治及防控技术的研究奠定了重要基础。

目录

声明

缩略语表(Abbreviation)

1.文献综述

1.1多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multicida , Pm）

1.2禽霍乱的临床特征、病理变化及致病机理

1.3 Pm的主要毒力因子

1.4 Pm的耐药性及主要机制

1.5 Pm疫苗的研究进展

1.6多杀性巴氏杆菌基因组测序研究进展

1.7 研究问题的由来

2.研究目的与意义

3.材料与方法

3.1实验材料

3.2实验方法

4.结果与分析

4.1 鸡场疾病的临床、实验室诊断及治疗

4.2 GX-Pm基因组的序列测定与分析

4.3 Pm基因缺失株的构建及致弱效果评价

5.讨论与结论

5.1讨论

5.2结论

参考文献

致谢

附录