棉花丝裂原活化蛋白激酶基因GbMPK3的功能鉴定

摘要

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号级联广泛存在于各种真核生物体内，在细胞信号传导的过程中具有重要作用。本研究从海岛棉Hai7124根系中分离到一个在受黄萎病菌侵染时上调表达的MAPK类基因GbMPK3，并分别在本氏烟和陆地棉YZ1中对其在植物抗非生物胁迫和生物胁迫中的功能和调控机理进行了分析，取得的主要结果如下:
　　1.GbMPK3的克隆及序列分析
　　从海岛棉Hai7124受黄萎病菌V991处理的RNA-seq数据库中分离到一条在黄萎病菌侵染时表达量明显变化的EST序列(CL1Contig1773)，通过RACE和Genome-walking获得该基因的全长和启动子序列。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现其编码的蛋白具有MAPK的典型特征，属于MAPK基因家族TEY亚家族A组的成员，并与拟南芥MPK3的同源度为68％，因此将其命名为GbMPK3。将GbMPK3蛋白的N端融合GFP，瞬时转化烟草表皮细胞，结果显示GbMPK3蛋白主要定位于细胞核。
　　2.GbMPK3的表达模式分析
　　利用RT-PCR和qPCR分析了GbMPK3的表达模式。结果表明GbMPK3的表达水平较低且具有组织特异性，在根系、花瓣、花药和纤维中表达量相对较高。GbMPK3在棉花根系中的表达还受到冷、高温、盐、甲基紫精(MV)和脱水等非生物逆境、水杨酸(SA)等激素以及黄萎病菌侵染的诱导。
　　3.超量表达GbMPK3提高了烟草对干旱和氧化胁迫的耐受性
　　构建了GbMPK3基因超量表达载体并分别转化烟草和棉花。通过抗性筛选和分子鉴定分别获得了高量表达GbMPK3的转基因烟草和棉花株系。对野生型和转基因烟草在成株期进行干旱胁迫处理，发现转基因烟草具有更强的耐旱性。表现为转基因系复水之后的株高和存活率显著高于野生型。生理生化分析发现超表达GbMPK3提高了烟草在干旱胁迫下抗氧化酶APX的基因表达和酶活性，从而减少了烟草细胞内的活性氧积累。用MV处理烟草种子和成株期烟草叶片，发现MV对野生型和转基因系都造成了氧化胁迫，但是野生型对MV更敏感。MV处理之后野生型烟草种子的萌发率和成株期叶盘的叶绿素含量均显著低于转基因植株。RT-PCR分析结果显示，GbMPK3超表达的烟草在MV处理后抗氧化酶APX的基因表达量高于野生型。推测超量表达GbMPK3增强烟草对干旱和氧化胁迫的耐受性可能与提高抗氧化酶的表达和活性有关。
　　4.超量表达GbMPK3影响了烟草对烟草花叶病毒(TMV)和灰霉病菌的抗性
　　对超量表达GbMPK3基因的烟草转基因系和野生型进行病原菌接种处理。转基因烟草对TMV的抗性增强，超表达GbMPK3降低了TMV在烟草中扩散和繁殖的速率;而接种灰霉病菌后转基因烟草则表现出更感病的表型。
　　5.超量表达GbMPK3降低了烟草和棉花对黄萎病菌的抗性
　　对超量表达GbMPK3的烟草和棉花转基因材料进行黄萎病菌接种实验，发现转基因烟草和棉花的抗病性都显著降低。受黄萎病菌侵染后，野生型和转基因材料都表现出叶片萎蔫、黄化等黄萎病的典型病征，但野生型的叶片黄化与萎蔫出现的时期晚于转基因系，具体表现为野生型的发病率和病指显著低于转基因系。利用VIGS方法抑制棉花中GbMPK3的表达，对GbMPK3沉默的棉花进行接种实验。接种黄萎病菌后，对照材料和抑制GbMPK3表达的材料之间没有观察到抗病性的差异，两者在叶片黄化和脱落程度上无明显区别。说明抑制GbMPK3表达对棉花抗黄萎病的影响不大，而超量表达GbMPK3显著减弱了植物对黄萎病菌的抗病性。
　　6.GbMPK3影响黄萎病菌侵染下棉花SA相关基因的表达
　　qPCR分析显示，无论是GbMPK3抑制表达、GbMPK3超量表达还是野生型的棉花根系中SA相关基因，如WRKY70、PR1和PR5等，在接种5天后相对于接水处理的对照组都显著上调。与野生型相比，GbMPK3超量表达转基因系中WRKY70、PR1和PR5等基因的表达水平显著升高;而抑制GbMPK3表达并未影响PR1和PR5的表达。这些结果说明棉花品种YZ1受黄萎病菌侵染后SA路径被激活，GbMPK3的超量表达增强了SA信号路径的激活水平。现有的一些研究结果表明，JA可能正调控植物对黄萎病菌的抗性，SA和JA信号路径通过WRKY70、NPR1等关键因子相互拮抗。因此，SA也可能影响棉花对黄萎病菌的抗性，但SA调控棉花抗性的具体机理、超量表达GbMPK3降低陆地棉对黄萎病菌的抗性与其显著升高的SA信号传导水平是否关联还有待进一步的研究。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 植物中的参与渗透胁迫响应的信号路径

1．2 植物抗病信号路径

1．3 MAPKs参与植物抗逆和抗病反应

1．3．1 植物中的MAPKs及分类

1．3．2 MAPKs与植物非生物胁迫

1．3．3 MAPKs与植物抗病

1．3．4 棉花中的MAPK基因

1．4 本课题研究的意义的目的

2 材料方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 植物基因组DNA及RNA的提取

2．2．2 RACE技术扩增GbMPK3的cDNA序列

2．2．3 GbMPK3全长cDNA和DNA序列的克隆及分析

2．2．4 Southern／Northern杂交

2．2．5 融合表达载体构建及烟草瞬时转化

2．2．6 GbMPK3启动子序列克隆及顺式作用元件分析

2．2．7 GbMPK3表达模式分析

2．2．8 RT-PCR和qPCR

2．2．9 RNA干涉、超表达和VIGS载体构建及受体植物遗传转化

2．2．10 转基因烟草非生物逆境胁迫处理

2．2．11 DAB染色，过氧化氢含量和APX酶活测定

2．2．12 叶绿素含量测定

2．2．13 转基因烟草和棉花生物胁迫处理

2．2．14 病情指数、发病率统计

2．2．15 病株剖杆和病原菌恢复培养

3 实验结果与分析

3．1 GbMPK3基因的克隆及序列分析

3．2 GbMPK3的亚细胞定位

3．3 GbMPK3基因的启动子元件及表达模式分析

3．3．1 GbMPK3基因的启动子克隆分析

3．3．2 GbMPK3的组织表达模式分析

3．3．3 GbMPK3在生物和非生物胁迫下的表达模式分析

3．4 超表达、干涉和VIGS载体构建及转基因植株获得

3．4．1 超表达、干涉和VIGS载体构建

3．4．2 烟草转基因材料的获得

3．4．3 棉花转基因材料的获得

3．5 GbMPK3基因参与植物对抗非生物胁迫

3．5．1 在烟草中超量表达GbMPK3增强了烟草对干旱的抗性

3．5．2 GbMPK3转基因烟草在干旱胁迫下ROS的清除能力增强

3．5．3 在烟草中超量表达GbMPK3增强了烟草对氧化胁迫的抗性

3．6 GbMPK3基因影响植物对病原菌的抗性

3．6．1 GbMPK3超量表达影响烟草对烟草花叶病毒和灰霉病菌的抗性

3．6．2 GbMPK3超量表达转基因烟草对黄萎病菌抗性降低

3．6．3 GbMPK3负调控棉花对黄萎病菌的抗性

3．6．4 GbMPK3影响棉花在黄萎病菌侵染下SA相关抗病基因的表达

3．6．5 VIGS技术干涉GbMPK3对棉花抗黄萎病菌的影响

4 讨论

4．1 GbMPK3属于A组MAPK基因，参与棉花对逆境的响应

4．2 GbMPK3超表达可能通过调控APX增加烟草抗旱性

4．3 GbMPK3影响烟草和棉花对黄萎病菌的抗性

4．4 GbMPK3影响黄萎病菌侵染下棉花SA相关基因的表达

参考文献

附录

附录1．植物总RNA提取方法

附录2．植物DNA提取方法

附录3．RACE技术扩增基因5’-和3’-UTR

附录4．TA克隆、热激转化和电击转化

附录5．PCR扩增反应体系及步骤

附录6．Southern／Northern杂交操作步骤

附录7．BP／LR反应

附录8．烟草瞬时转化

附录9．RNA反转录

附录10．磷酸缓冲液和DAB染液的配制

附表1．引物序列

附表2．用于GbMPK3序列比对的蛋白序列

攻读学位期间已发表和待发表论文

国家专利

致谢