光周期对草原龙胆生长发育的影响及相关基因的功能分析

摘要

草原龙胆又名草原龙胆，是国际市场上非常流行的切花，矮生品种的培育使其在园林中的应用形式更为广泛。本文对‘德拉迷斯’草原龙胆展开光周期方面的研究，一方面从栽培的角度研究‘德拉迷斯’的光周期和花芽分化特性;另一方面从分子的角度探讨光周期调控‘德拉迷斯’开花的机理。
　　本研究的主要结果如下:
　　1.通过7种不同日长的光周期处理，确定了‘德拉迷斯’草原龙胆为量性长日照植物，促进开花的临界日长为14h。光照时间越长，植株生长越高，而真叶数减少。通过比较几种处理下‘德拉迷斯’的开花时间以及开花时的品质，确定14h是生产上能保证得到较好开花品质且比较节能的光周期。
　　2.采用石蜡切片法对‘德拉迷斯’的花芽分化过程进行显微观察，可以将为期3周的分化过程划分为6个时期:营养生长期、花芽分化初期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。据此，将花芽分化初期确定为成花转变时期，此时顶端分生组织向上升起，并变得宽阔平坦，出现在萼片原基分化之前。
　　3.通过观测‘德拉迷斯’花芽分化时期对应的营养生长指标，建立了花芽分化时期(DP)与营养生长(VGTs)之间的相关性。结果显示，株高、冠幅、真叶数和出苗周数都与花芽分化时期存在显著相关性，可以用来预测花芽分化进程。根据回归方程推算，‘德拉迷斯’成花转化时期发生在21片真叶期。因此，建议生产上在21片真叶之前用14h光周期进行处理，以期加速开花。
　　4.采用同源克隆法从草原龙胆中克隆到光周期途径基因EgGI的gDNA和cDNA全长。通过几种光周期下的实时定量表达(qRT-PCR)分析均表明，EgGI受内源昼夜节律钟的调控，其表达量在光照8-12hr后达到峰值，至暗期下降。另外，分析在长、短日照下成花转变前后EgGI的表达水平，发现LD条件下EgGI的表达水平均明显高于SD条件下，推测EgGI可能参与草原龙胆成花转变之前的调控过程。
　　5.从草原龙胆中克隆到两个CO基因的同源基因EgCOL1和EgCOL2。通过同源比对和进化树分析，发现EgCOL1划分在CO基因家族的第Ⅰ组a亚类，与拟南芥AtCOL1和AtCOL2同源性最高;EgCOL2划分在第Ⅰ组c亚类，与拟南芥AtCOL5同源性最高。
　　6.分析EgCOL1和EgCOL2在几种光周期下的表达节律，结果表明EgCOL1的表达受内源昼夜节律钟调控，而EgCOL2在四种光周期下昼夜节律性不明显。另外，分析EgCOL1和EgCOL2在成花转变前后的表达水平，发现两个基因在LD下的表达水平都要高于SD，且在成花转变时期都有明显的表达峰值，其中EgCOL1的对比更显著。推测这两个基因可能都参与了草原龙胆的成花转变过程。
　　7.分别构建EgCOL1和EgCOL2基因的超表载体转化烟草，成功获得转基因烟草。表型观测发现，超量表达EgCOL1的烟草与对照在开花时间和外部形态特征上没有明显差别。超量表达EgCOL2的烟草出现了明显的早花现象，qRT-PCR分析发现，强表型植株EgCOL2表达水平明显较高，且上调烟草NtFT和NtSOC1的表达。说明EgCOL2基因具有促进烟草早花的功能。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．问题的由来

2 高等植物成花机理的研究进展

2．1 成花诱导

2．2 花发育的形态学研究

2．3 影响成花的因素

3 高等植物光周期调控的研究进展

3．1 光周期作用的特点

3．2 光周期临界日长

4 高等植物光周期调控的分子机理

4．1 光周期信号的接受与感应

4．2 植物的昼夜节律钟系统

5 光周期途径关键基因GI、CO和FT的研究进展

5．1 GI基因的研究进展

5．2 CO基因及家族成员研究进展

5．3 FT基因的研究进展

6．光周期调控草原龙胆开花的研究进展

6．1 草原龙胆的花芽分化特性研究进展

6．2 草原龙胆光周期调控开花的研究进展

7．研究目的和意义

第二章 草原龙胆的光周期特性和花芽分化特性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 基本研究方法

2 结果与分析

2．1 不同光周期对‘德拉迷斯’草原龙胆生长和开花的影响

2．2 ‘德拉迷斯’草原龙胆花芽分化特性的研究

3 讨论

3．1 ‘德拉迷斯’草原龙胆的光周期类型

3．2 ‘德拉迷斯’的临界光周期和最佳光周期

3．3 不同光周期对‘德拉迷斯’生长和开花的影响

3．4 ‘德拉迷斯’的花芽分化特性

3．5 ‘德拉迷斯’成花转变时期的确定

4 结论

5 后续计划及建议

第三章 草原龙胆光周期基因GIGANTEA的克隆、表达和功能分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 草原龙胆EgGI基因的克隆

1．3 EgGI基因的生物信息学分析

1．4 EgGI基因的时空表达分析

1．5 EgGI表达载体的构建

1．6 农杆菌介导转化草原龙胆

1．7 转基因草原龙胆鉴定和表型观测

2 结果与分析

2．1 草原龙胆EgGI基因的克隆

2．2 草原龙胆EgGI基因的时空表达分析

2．3 EgGI表达干涉载体的构建

2．4 转基因植株的鉴定

3 讨论

3．1 Tail-PCR的应用

3．2 EgGI基因的特点

3．3 EgGI的表达受内源昼夜节律钟的调控

3．4 EgGI基因可能调控草原龙胆的成花转变

3．5 EgGI基因的功能分析

4 结论

5 建议与后续计划

第四章 草原龙胆光周期基因CONSTANS的克隆、表达和功能分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 草原龙胆EgCOL基因的克隆

1．3 EgCOL基因的生物信息学分析

1．4 EgCOL基因的时空表达分析

1．5 EgCOL1和EgCOL2表达载体的构建

1．6 农杆菌介导转化草原龙胆和烟草

1．7 转基因植株分析

2 结果与分析

2．1 草原龙胆EgCOL基因的克隆

2．2 EgCOL1和EgCOL2基因生物信息学分析

2．3 EgCOL1和EgCOL2基因的时空表达分析

2．4 EgCOL1和EgCOL2表达载体的构建

2．5 转基因草原龙胆的获得及表型观测

2．6 转基因烟草的获得及表型分析

3 讨论

3．1 EgCOL1和EgCOL2基因的进化分析

3．2 EgCOL1和EgCOL2在不同组织部位的表达

3．3 EgCOL1和EgCOL2具有不同的昼夜节律性

3．3 EgCOL1和EgCOL2在成花转变过程中的作用

3．4 EgCOL2参与草原龙胆开花时间的调控

3．5 EgCOL1和EgCOL2可能受到EgGI基因的调控

4 结论

5 建议与后续计划

参考文献

附录Ⅰ 实验中用到的引物

附录Ⅱ Tail-PCR扩增程序

附录Ⅲ 草原龙胆、烟草CTAB法提取叶片DNA

附录Ⅳ 大肠杆菌热激步骤

附录Ⅴ 大肠杆菌质粒提取

附录Ⅵ 农杆菌感受态的制备及电击转化

附录Ⅶ 草原龙胆叶盘转化法步骤

附录Ⅶ 烟草叶盘法转化步骤

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致谢