Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中两个Ⅲ型聚酮合酶基因orf18和orf24功能分析及PA4启动子活性研究

摘要

Streptomyces sahachiroi ATCC33158因产生抗肿瘤药物azinomycin B而受到了研究者的关注。在该链霉菌基因组中除了azinomycin B的生物合成基因簇以外，还发现含有丰富的聚酮合酶（PKS）基因和非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因。为了挖掘这些有价值的基因资源，本实验室对Streptomyces sahachiroi ATCC33158基因组进行了扫描测序。本研究在分析和完善该链霉菌基因组序列的基础上，对其中的两个III型PKS基因orf18和orf24的功能以及来源于azinomycin B生物合成基因簇的PA4启动子活性展开研究工作。具体内容如下：
　　1.成功构建了一个插入片段大小为5Kb的S. sahachiroi ATCC3315基因组文库，通过文库克隆子的末端测序，利用生物信息学软件DNAStar-SeqMan将获得的序列信息与全基因组扫描测序的结果进行比对分析，发现有106个克隆跨越在两个contig之间，可以用于contig的定位及gap的填补，为后续的基因组图谱的制作奠定了基础。
　　2.两个III型PKS基因orf18和orf24分别位于染色体和线性质粒上。首先通过RT-PCR分析证实这两个基因在原宿主内都可以正常转录表达，然后利用同源双交换的方法获得了orf18和orf24基因的敲除突变菌株及回补菌株。HPLC和LC-MS分析其发酵产物，结果显示orf18或orf24的缺失能够明显降低原宿主中苯甲酸的产量，表明这两个III型PKS基因均参与了苯甲酸的合成。最后在大肠杆菌系统中超量表达Orf18和Orf24蛋白，通过纯化获得纯蛋白后，尝试与底物丙二酰辅酶A进行体外反应，反应产物还需要进一步的优化及结构鉴定。
　　3.前期在研究azinomycin B的合成调控机制时，我们利用EGFP报告系统发现在这个基因簇中许多启动子的活力都不弱于常用的链霉菌组成型强启动子 PermE*，尤其是 PA4启动子。为了更加有力的说明PA4启动子的活性，本研究利用另外一个报告系统–邻苯二酚双加氧酶基因xylE，以红霉素抗性基因启动子PermE*为阳性对照，通过原位菌落检测和无细胞悬液检测方法，在不同链霉菌宿主细胞内证明PA4具有组成型强启动子活力，在对数生长期及稳定期早期PA4启动子的活力甚至明显超过PermE*。

目录

声明

缩略语

第一章 前言

1.1 链霉菌简介

1.2 聚酮类化合物的生物合成

1.3 其他天然产物生物合成

1.4 III型聚酮合酶研究进展

1.5 链霉菌报告基因发展

1.6 研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 S. sahachiroi ATCC 33158基因组序列测序缺口填补

3.2 S. sahachiroi ATCC 33158中III型PKS基因orf18的功能研究

3.3 S. sahachiroi ATCC 33158中III型PKS基因orf24功能研究

3.4 PA4启动子活性的研究

第四章 讨论与展望

4.1 S. sahachiroi ATCC 33158基因组序列测序缺口填补

4.2 S. sahachiroi 中两个III型PKS基因orf18和orf24的研究

4.3 PA4启动子活性研究

附表1

参考文献

致谢