胶胞炭疽菌ES026 T-DNA插入突变体库的构建

摘要

我国传统药用植物蛇足石杉的次级代谢产物石杉碱甲是一种高效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，是治疗老年痴呆症的一个前景药物。人工合成石杉碱甲工艺复杂、成本昂贵、且得率较低，目前市场上石杉碱甲主要来源于野生蛇足石杉等石杉科植物。但石杉科植物生长周期长、生态环境复杂、资源开采过度、因含内生菌人工组培快繁又难以获得无菌苗，使得天然石杉碱甲的产量受到极大限制。基于内生真菌与其共生植物可以交换遗传物质这一理论，从蛇足石杉中分离产石杉碱甲的内生真菌已成为新的研究热点。本实验室在前期研究工作中已从蛇足石杉中分离出一株产石杉碱甲的内生真菌Colletotrichum gloeosporioidesES026，并已经申请专利。目前为止所获得的产石杉碱甲的菌株所产的石杉碱甲量还很低，整个石杉碱甲生物合成途径仍不完全，相关基因的研究鲜见报道，因此利用内生菌大量生产石杉碱甲还未应用到实践当中。本研究以分离得到的内生真菌ES026为材料，通过农杆菌介导转化，构建T-DNA插入突变体库，并利用TAIL-PCR与Inverse-PCR等技术手段对石杉碱甲合成途径中的相关基因进行克隆。旨在为培育石杉碱甲高产菌株、探究石杉碱甲合成途径，从而为利用微生物生产石杉碱甲奠定基础，同时为相关研究提供参考。主要研究结果如下:
　　1.建立了农杆菌介导的C.gloeosporioidesES026的高效转化体系。在共培温度为25℃，共培时间为48h，400μM的乙酰丁香酮(AS)，农杆菌浓度OD600=0.3-0.5，孢子浓度为1×106个/mL时，转化效率最高，达95个转化子/皿。目前利用此优化条件已建立了约含4000个转化子的胶孢炭疽菌ES026T-DNA插入突变体库。
　　2.对农杆菌介导C.gloeosporioidesES026的突变体库的遗传稳定性进行了评估。从突变体库内随机选取13个转化子，在不含潮霉素和头孢霉素的PDA上连续培养5代，然后转到含200μg/mL潮霉素和150μg/mL头孢霉素的选择培养基上，结果发现所有测试的转化子各子代均能在选择培养基上生长，而野生型菌株C.gloeosporioidesES026不能生长。而且通过潮霉素特异性引物扩增，所有测试的转化子各子代和农杆菌载体均在1101bp处有扩增条带，而野生型菌株C.gloeosporioidesES026未扩增出条带，这说明T-DNA标记转化子在遗传上是稳定的。
　　3.从突变体库中任选100个突变菌株对其发酵产物进行了表型的筛选，得到EST010005、EST010010、EST010021、EST010043、EST010044等5株表型较野生型菌株ES026有变化的菌株。对这5株突变菌株的石杉碱甲含量进行了液相分析，结果发现，突变菌株EST010044的石杉碱甲含量（7.73μg.g-1CDW）显著高于野生型菌株ES026的石杉碱甲含量（4.23μg.g-1CDW），约为1.83倍。而突变菌株EST010005(2.75μg.g-1CDW)、EST010043（2.78μg.g-1CDW）的石杉碱甲含量显著低于野生型菌株ES026，分别为其含量的0.65、0.66倍。
　　4.为了评价表型突变菌株的T-DNA插入拷贝数，我们采取了基因组southern杂交分析的技术手段。经过southem杂交分析结果表明，有四个突变菌株(EST010005、EST010021、EST010010和EST010044)是单拷贝，单拷贝率达到了80％,而仅有一株(EST010043)是双拷贝，说明该插入体库具有较高的单拷贝比例。
　　5.通过TAIL-PCR和Inverse-PCR技术对EST010044的侧翼序列进行扩增，序列拼接后经比对发现与胶胞炭疽菌（C.gloeosporioides）的甲基转移酶(methyltransferasedomainprotein)具有很高的同源性。

目录

声明

摘要

1．文献综述

1．1 老年痴呆症

1．1．1 老年痴呆症现状

1．1．2 老年痴呆症的发病机理

1．2 石杉碱甲

1．2．1 石杉碱甲天然来源

1．2．2 石杉碱甲化学来源

1．2．3 石杉碱甲微生物来源

1．3 农杆菌介导遗传转化的研究

1．3．1 农杆菌介导真菌的遗传转化(ATMT)

1．3．2 影响农杆菌介导丝状真菌的遗传转化效率的因素

1．4 石杉碱甲生物合成途径的研究

1．5 本研究的立题依据、研究思路及意义

1．5．1 立题依据

1．5．2 研究思路

1．5．3 研究意义

2 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026的遗传转化

2．1 供试材料

2．1．1 菌株及载体

2．1．2 培养基及化学试剂

2．1．3 抗生素

2．1．4 主要试验仪器

2．2 方法

2．2．1 菌株的培养

2．2．2 农杆菌介导转化的菌种材料的制备

2．2．3 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026的转化的抗生素浓度的筛选

2．2．4 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026转化的方法

2．2．5 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026转化子的分子鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 胶胞炭疽菌ES026孢子的显微形态

2．3．2 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026的转化的抗生素浓度的筛选

2．3．3 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026转化子的分子鉴定

2．4 讨论

3 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026的突变体库的构建

3．1 供试材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基、化学试剂、抗生素及主要试验仪器

3．2 方法

3．2．1 转化的最佳共培时间的筛选

3．2．2 转化的最佳共培温度的筛选

3．2．3 转化的农杆菌的最佳浓度的筛选

3．2．4 转化的孢子最佳浓度的筛选

3．2．5 转化的孢子最佳成熟期的筛选

3．2．6 转化的诱导剂乙酰丁香酮最佳浓度的筛选

3．2．7 转化子遗传稳定性的鉴定

3．2．8 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 转化的最佳共培时间的筛选

3．3．2 转化的最佳共培温度的筛选

3．3．3 转化的农杆菌的最佳浓度的筛选

3．3．4 转化的孢子最佳浓度的筛选

3．3．5 转化的孢子最佳成熟期的筛选

3．3．6 诱导剂乙酰丁香酮最佳浓度的筛选

3．3．7 转化子遗传稳定性的鉴定

3．3．8 农杆菌介导胶胞炭疽菌ES026的最佳转化条件

3．4 讨论

4 石杉碱甲生物合成相关基因的克隆

4．1 供试材料

4．1．1 供试菌株

4．1．2 化学试剂

4．1．3 酶和试剂盒

4．1．4 主要试验仪器

4．2 方法

4．2．1 表型突变菌株的筛选

4．2．2 表型突变菌株的southern分析

4．2．3 突变菌株的液相分析

4．2．4 突变菌株的T-DNA插入位点侧翼序列分析

4．2．5 克隆序列的分析

4．3 结果与分析

4．3．1 表型突变菌株的筛选

4．3．2 表型突变菌株的southern分析

4．3．3 突变菌株的液相分析

4．3．4 突变菌株的T-DNA插入位点侧翼序列分析

4．4 讨论

5 结论与展望

参考文献

附录

致谢