中华鳖肠道益生菌的筛选与应用

摘要

本实验从中华鳖(Trionyxsinensis)肠道内分离出了对中华鳖常见致病菌具有较强拮抗作用的潜在益生菌，对筛选出来的益生菌的特性进行检测和研究，并进一步研究了在饲料中添加该益生菌对中华鳖生长、免疫的影响，为中华鳖养殖行业中益生菌的应用提供基础。本研究的主要结果如下:
　　(1)通过点种法初筛和牛津杯法复筛，从中华鳖肠道筛选到1株对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)以及豚鼠气单胞菌（A.caviae）具有拮抗作用的菌株Dec-43。对该菌株进行形态及生理生化特征分析，结果与屎肠球菌的生理生化特征一致;提取细菌基因组DNA，通过16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，该菌株的16SrRNA基因克隆到了一个长度为1448pb的片段，经测序和序列比对，该片段与Genbank中屎肠球菌的序列相似性达99％，因此，该菌株确定为屎肠球菌（Enterococcusfaecium）。通过单因素试验确定了该菌株的最佳生长温度、盐度、初始pH、接种量分别为36℃，盐度0.6％，培养基初始pH值7，接种量10％;通过正交试验，确定了培养基中碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）最适含量分别为15g/L和10g/L。
　　(2)将中华鳖随机分成四组，分别投喂基础饲料(C)，添加106cfu/g(E1)、107cfu/g(E2)和108cfu/g(E3)浓度Dec-43的基础饲料，饲喂56d后发现:三个实验组(E1、E2、E3)的特定生长率显著高于对照组(P＜0.05)，实验组2(E2)的相对增重率显著高于对照组(P＜0.05);实验组比对照组的中华鳖的血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、髓过氧化物酶活性以及补体C3、C4表现出不同程度的升高。该结果表明，菌株Dec-43对中华鳖生长及免疫功能具有促进作用。
　　(3)当中华鳖饲养56d后，每组分别注射嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和生理盐水，并检测肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织在不同时间点(12、24、36、48、60、72h)ATF4基因和CD9基因的表达量。结果显示，肝脏中，E2实验组ATF4基因的表达量在24h和48h的表达量显著低于对照组，只有在36h高于对照组;脾脏中，E1实验组ATF4基因的表达量在12、36、48、60h均显著高于对照组;肾脏中，E1实验组ATF4基因的表达量比对照组表达量先达到最大值，也先下降;肠道中，E1实验组ATF4基因的表达量在12到48h的表达量均低于对照组，其他时间与对照组无显著差异性;实验结果表明，投喂Dec-43后，能降低肝脏和肠道中炎症反应，促使肾脏迅速对细菌感染发生免疫反应，促进机体迅速恢复稳态，同时也能提高脾脏的免疫应答，及时清除外界病原菌。肝脏中，E3实验组CD9基因的表达量在12h显著高于对照组，24h显著低于对照组，其后下降到与对照组无显著性差异;脾脏中，E1实验组CD9基因的表达量在12h显著高于对照组，其后与对照组无显著差异性，并且在72h时显著低于对照组;在肾脏中，实验组E1、E2、E3的CD9基因表达量，在除60h以外的时间点，均显著高于对照组;在肠道组织中，E1实验组只在48h时，CD9的表达量显著高于对照组，在60h时与对照组无显著差异性，其他时间点均显著低于对照组，E2实验组在48h和60h显著高于对照组，其他时间显著低于或与对照组无显著差异，E3实验组只在48h显著高于对照组，在12、36h时显著低于对照组，其他时间点与对照组无显著差异性;实验结果表明，投喂Dec-43后，能加快肝脏和脾脏对外界病原菌反应，加快机体恢复稳态，同时也能促进肾脏中T细胞的活化，有利于保持肠道在感染初期的稳态，感染中期活化宿主T细胞，感染后期恢复肠道内稳态。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 益生菌简介

2 常用益生菌种类

3 益生菌的筛选

4 益生菌的主要作用机理

4．1 营养作用

4．2 拮抗作用

4．3 水质调节作用

4．4 益生菌对宿主免疫作用的影响

5 益生屎肠球菌

5．1 屎肠球菌肠道菌素的功能特性

5．2 对宿主肠道菌群的调节作用

5．3 对病原微生物的抑制作用

5．4 对宿主生长性能的影响

5．5 对宿主免疫功能的影响

5．6 其他益生作用

6 本研究的目的和意义

第二章 中华鳖肠道益生菌的筛选、鉴定及生长特性研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 益生菌的初筛结果

2．2 益生菌的复筛结果

2．3 益生菌的酸耐受实验

2．4 菌株生理生化结果分析以及16S rRNA基因序列分析结果

2．5 Dec-43的生长曲线

2．6 不同温度对Dec-43生长的影响

2．7 不同盐度对Dec-43生长的影响

2．8 不同初始pH对Dec-43生长的影响

2．9 不同接种量对Dec-43生长的影响

2．10 不同碳氮比对Dec-43生长的影响

3 讨论

第三章 益生菌对中华鳖生长、免疫的影响

1 材料方法

1．1 细菌培养

1．2 实验饲料

1．3 实验分组和动物饲养

1．4 生长性能评估

1．5 免疫指标测定

1．6 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 投喂Dec-43对中华鳖生长性能的影响

2．2 投喂Dec-43对中华鳖非特异性免疫功能的影响

3 讨论

第四章 益生菌对中华鳖感染嗜水气单胞菌后免疫相关基因表达的调节

1 材料方法

1．1 细菌培养

1．2 实验饲料

1．3 实验分组和动物饲养

1．4 嗜水气单胞菌攻毒

1．5 样品收集

1．6 组织总RNA的提取

1．7 组织cDNA的制备

1．8 Real-Time PCR

1．9 数据分析

2 结果

2．1 RNA质量的检测

2．2 反转录效果的检测

2．3 感染嗜水气单胞菌后肝脏中免疫相关基因的表达量的变化

2．4 感染嗜水气单胞菌后脾脏中免疫相关基因的表达量的变化

2．5 感染嗜水气单胞菌后肾脏中免疫相关基因的表达量的变化

2．6 感染嗜水气单胞菌后肠道中免疫相关基因的表达量的变化

3 讨论

参考文献

附录

致谢