长、短光周期敏感雄性不育水稻育性差异蛋白研究

摘要

杂交水稻技术极大的提高了我国粮食的产量，以光温敏核不育水稻为基础发展起来的两系法杂交水稻已在全国大面积推广应用，在保障我国粮食安全方面发挥着巨大作用。两系法杂交水稻使用的不育系育性受光温条件决定，生产中要求其在不育条件下完全败育作为母本进行杂交种子生产，而在可育条件下恢复育性用于繁殖自身，对这种受光温条件精细控制的育性转换特性及机理的研究是两系法杂交水稻应用的技术基础。目前存在两种育性光温反应完全相反的不育系:长光高温不育型和短光低温不育型，这为研究光温敏核不育水稻的育性变化机理提供了独特的材料。
　　对光温敏核不育水稻育性转换的基础研究工作持续了40多年，涵盖了遗传学，分子生物学，生物化学，细胞生物学等各个领域，但对其育性调控机理至今没有完全阐述清楚，短光敏核不育水稻是一类新的种质资源，对它育性转换机理的研究开展的还比较少。本研究采用蛋白质组学分析技术，选用长光敏感不育特性典型的农垦58S，短光敏感不育特性典型的D52S为材料，在严格的育性诱导条件下，比较两类育性光反应特性完全相反的材料在不育和可育条件下剑叶、叶鞘及幼穗的蛋白质表达谱，通过质谱鉴定，生物信息学分析，qPCR及Western Blot验证等来分析雄性育性转换过程中发生的基因表达事件，旨在为揭示长、短光敏核不育水稻的育性转换机制提供更多有价值的线索，取得的主要研究结果如下:
　　1.在武汉7月份相同自然温度条件下，对D52S和农垦58S在育性转换敏感期分别进行14.5 h长光照、10h短光照处理后统计花粉可染率及自交结实率，结果显示D52S在长光条件下花粉可染率为89.06％，结实率可达54.84％，经短光照处理后花粉完全败育。农垦58S在长光条件下花粉可染率和结实率均为0，在短光照处理条件下花粉可染率达84.68％，后期结实率为25.43％。说明这两个材料是由光周期主导的育性转换特性完全相反的光敏核不育系。
　　2.采用双向电泳技术分离了两个不育系在不同光周期处理条件下花粉母细胞减数分裂期剑叶、叶鞘及幼穗的蛋白表达谱，通过质谱技术成功从D52S三个组织中鉴定到53个差异蛋白点，从农垦58S三个组织中鉴定到40个差异蛋白点，其中有13个蛋白在两个品种中都出现且它们在各自品种不育及可育条件下的变化趋势一致。生物信息学及蛋白功能聚类分析将这93个差异蛋白点划分为8个类别:代谢相关蛋白、次生代谢相关蛋白、能量相关蛋白、胁迫与防御蛋白、蛋白合成与加工、信号转导与调控、细胞结构与生长和功能未知蛋白。对不同组织的差异蛋白点进行整理分析显示光周期诱导育性转变的一个复杂的蛋白调控网络。
　　3.利用qPCR技术对在不同光周期处理下差异表达明显且稳定的类黄酮合成途径中的关键酶4-香豆酸:辅酶A连接酶9(4CLL9)，查尔酮合酶(CHS)以及糖代谢过程中的UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和蔗糖合酶1(SUS1)进行转录分析，发现CHS和4CLL9的表达量在D52S和农垦58S不育及可育幼穗中均有明显差异，说明这两个基因与育性的表现密切相关，可能是参与光敏育性转换过程的重要因素。
　　4.通过Western Blot实验进一步验证CHS，4CLL9在两个水稻品种不育及可育状态下的表达情况，结果显示CHS和4CLL9在D52S可育幼穗中的表达量均高于不育幼穗，4CLL9在农垦58S内同样也是在可育株中表达量高。分别测定比较两个不育系幼穗发育Ⅵ期，Ⅶ期不育及可育株中类黄酮的含量，发现在Ⅵ期不育幼穗中的类黄酮物质含量高于可育幼穗，但是在Ⅶ期无论是在D52S还是在农垦58S中，可育幼穗中的类黄酮物质含量都明显高于不育幼穗，提示CHS和4CLL9蛋白的表达变化对类黄酮物质合成含量的影响可能具有滞后性。结合2D，qPCR及Western Blot的实验结果表明可育水稻中CHS和4CLL9的蛋白表达量与植株类黄酮含量成正相关，说明CHS和4CLL9的确与植株育性的转换密切相关。
　　本研究获得了育性光反应特性完全相反的两种光敏核不育水稻在不同育性条件下大量差异表达的蛋白数据，为进一步深入研究光周期诱导育性转换的机制提供了参考信息。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 引言

1．2 水稻细胞质雄性不育(CMS)

1．2．1 水稻CMS类型及育性相关基因

1．2．2 水稻CMS的产生机制

1．2．3 水稻CMS的育性恢复机理

1．3 水稻光温敏核雄性不育(PTGMS)

1．3．1 水稻PTGMS的种质资源及其分类

1．3．2 水稻PTGMS的育性转换模式

1．3．3 水稻PTGMS的细胞学及生理生化特性研究

1．3．4 水稻PTGMS的蛋白质组学研究

1．3．5 水稻PTGMS基因的定位与克隆

1．3．6 水稻PTGMS育性调控机理研究

1．4 研究目的与意义

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验材料的种植及光周期处理

2．3 实验材料的采集

2．4 水稻花粉的育性鉴定

2．5 双向电泳(2-DE)及质谱分析

2．5．1 水稻不同组织蛋白样品制备

2．5．2 蛋白质样品预处理

2．5．3 蛋白质含量测定

2．5．4 第一向等点聚焦(IEF)

2．5．5 第二向SDS-PAGE垂直板电泳

2．5．6 蛋白凝胶染色

2．5．7 凝胶扫描与图像分析

2．5．8 蛋白点的脱色与胶内酶解

2．5．9 MALDI-TOF／TOF-MS质谱分析

2．5．10 差异表达蛋白的生物信息学分析

2．6 荧光定量PCR(qPCR)

2．6．1 总RNA的提取

2．6．2 DNase Ⅰ处理及RNA质量检测

2．6．3 反转录及产物的PCR检测

2．6．4 引物设计及qPCR分析

2．7 Western Blot

2．7．1 人工合成多肽

2．7．2 多克隆抗体制备及抗体纯化

2．7．3 蛋白样品制备

2．7．4 SDS-PAGE

2．7．5 蛋白免疫印迹分析

2．8 类黄酮含量的测定

3．结果与分析

3．1 光周期处理对花粉育性转换的诱导

3．2 水稻不同组织双向电泳图像分析及差异蛋白点的质谱鉴定

3．2．1 凝胶图像分析与蛋白质谱鉴定

3．2．2 D52S和农垦58S差异表达蛋白的比较分析

3．3 差异表达蛋白的功能与聚类分析

3．4 差异表达蛋白的qPCR分析

3．4．1 RNA质量及反转录检测和qPCR条件优化

3．4．2 基因表达的相对定量分析

3．5 差异表达蛋白的Western Blot分析

3．6 类黄酮含量分析

4．讨论

4．1 D52S的育性光反应特性及应用价值

4．2 蛋白质表达差异凝胶图的分析

4．3 差异表达蛋白与育性的关系

4．3．1 次生代谢相关蛋白

4．3．2 能量与代谢相关蛋白

4．3．3 蛋白质的合成与加工

4．3．4 胁迫与防御蛋白

4．3．5 信号转导调控与细胞结构生长相关蛋白

4．4 光周期诱导育性转变的蛋白调控网络

4．5 转录水平、蛋白免疫印迹和类黄酮含量分析

5．结论与下一步研究的思考

5．1 结论

5．2 下一步研究的思考

参考文献

在读期间发表或待发表论文

致谢