甜菜夜蛾蛹黑突变体的适合度变化及其黑化机制研究

摘要

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)（鳞翅目:夜蛾科）是一种重要的世界性分布的多食性农业害虫。甜菜夜蛾蛹黑突变体(Spodoptera exigua melanie mutant，SEM)是2003年自湖北省荆州市棉田中采集的正常型甜菜夜蛾(Spodoptera exiguawild-type，SEW)经室内用人工饲料饲养至6代出现，其表型为蛹黑色，至今12年，蛹黑色性状稳定，未发生任何分离变化或回复突变，成为甜菜夜蛾的一个稳定的蛹黑突变品系(SEM)。本研究对SEM的形态进行连续观察，对适合度变化进行了系统比较研究，研究了黑色素合成相关基因在SEM品系和SEW品系之间的差异表达及其转录调控机制，为深入认识蛹黑突变形成机制，进一步解释蛹黑突变与相关生物学性状改变之间的联系提供理论依据，为全面了解SEM品系产生的机制提供理论基础。取得以下研究结果:
　　1甜菜夜蛾蛹黑突变品系较正常品系的适合度明显提高
　　甜菜夜蛾SEM品系在蛹期表现出整体黑化，在卵期、幼虫期、成虫期与SEW品系无显著差异;SEM品系化蛹后6h完成蛹表皮的黑化过程;SEM品系的世代发育速度比SEW品系显著加快，相比SEW品系蛹重增加13.16％、交配率提高25.60％、交配次数增多66.67％、产卵量提高148.19％，有更高的净生殖率（R0=275.66）和种群增长指数（I=123.73）;SEW和SEM品系之间交配次数最高的是两品系杂交组合（♀SEW×♂ SEM为2.40±1.30次;♀SEM×♂ SEW为2.43±1.22次），其次是SEM品系自交（1.97±1.01次），最低的是SEW自交(1.44±0.62次)。这些结果均表明SEM品系适合度较SEW有明显提高，与已有报道的多数实验室发现的黑化昆虫适合度较正常品系普遍降低的现象正好相反。综合分析本研究结果和已有报道的14例黑化昆虫的适合度变化研究结果，黑化昆虫的适合度变化不依赖于黑化来源、黑化时期和黑化类型等因素。
　　2酪氨酸羟化酶过量表达是甜菜夜蛾SEM产生的主要原因
　　运用简并引物PCR克隆得到酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)基因、多巴脱羧酶（Dopa decarboxylase，DDC）基因和漆酶2（Laccase2）基因片段，并通过RT-PCR方法比较了SEW和SEM品系中三个基因的表达水平，发现SEM品系中TH和DDC过表达;运用RACE技术克隆分别得到两品系TH和DDC的cDNA序列，且运用qRT-PCR技术研究了这两个基因在SEW和SEM品系化蛹前后表皮组织中的表达谱;序列比对分析结果表明SEW和SEM品系的TH和DDC编码的氨基酸序列没有差异;在SEW和SEM化蛹前后，TH表达丰度普遍高于DDC,在预蛹期，SEM中TH和DDC相对表达量分别是SEW中的15.19倍和32.44倍，在0h蛹期，DDC在SEM品系的相对表达量是SEW中的3.08倍;通过注射dsRNA干扰SEM五龄幼虫的TH,能在一定程度上使SEM蛹色变浅;用TH的抑制剂(3-IT)饲喂SEM品系五龄幼虫至化蛹，蛹的黑色变浅程度随3-IT浓度提高而增大，0.75 mg/g3-IT可以使68.2％SEM蛹黑色出现变浅;当用1 mg/g DDC的抑制剂(L-α-Methyl-DOPA)饲喂SEM品系五龄幼虫至化蛹，只有20％ SEM蛹的黑色发生较小程度的变浅。结果表明TH和DDC的过量表达与SEM品系的蛹黑表型相关，且TH的作用比DDC更重要。
　　3酪氨酸羟化酶基因启动子结构预示复杂的调控机制
　　通过Genome Walking技术克隆得到美国甜菜夜蛾正常型(US wild-type)、SEW品系和SEM品系的TH转录起始位点上游2.38kb启动子序列;运用JASPAR数据库对TH基因启动子区的顺势作用元件进行预测，找到24个转录因子100％相似的作用元件，数目共计55个;在TH启动子区内找到7个类似核受体转录因子βFTZ-f1作用元件的位点;运用双萤光素酶报告分析系统，在Sf9昆虫细胞中研究了TH基因启动子活性，定位了TH基因启动子基础活性区域和调控区域。
　　4βFTZ-f1基因在甜菜夜蛾SEM中过量表达
　　综合运用Genome Walking技术和3'RACE技术克隆得到甜菜夜蛾US wildtype、SEW和SEM品系的βFTZ-f1的cDNA序列，并且运用RT-PCR和qRT-PCR技术研究了βFTZ-f1在SEW和SEM品系化蛹前后表皮组织中的表达谱;序列比对分析结果表明SEW和SEM品系的βFTZ-f1编码的氨基酸序列有一个氨基酸不同，SEM品系和US wild-type有四处氨基酸差异;预蛹晚期βFTZ-f1表达水平最高，在SEM表皮中的表达量是SEW中的7.48倍;0h蛹期，βFTZ-f1在SEM表皮中的表达量是SEW中的1.74倍;说明βFTZ-f1基因过表达可能与SEM蛹黑表型形成有关。
　　5酪氨酸羟化酶基因受到β FTZ-f1和FTZ的正向调节
　　运用真核表达载体和双萤光素酶报告分析系统，在Sf9昆虫细胞和人的HeLa细胞中过表达βFTZ-f1分别可以将TH启动子活性提高2.66倍和1.6倍;Sf9细胞内过表达βFTZ-f1的辅激活子FTZ可以将TH启动子活性显著地提高1.79倍;通过EMSA试验在TH启动子区定位了一个FTZ的结合位点，未能定位到βFTZ-f1结合位点;FTZ结合位点的缺失和突变不影响βFTZ-f1和FTZ对TH启动子活性的上调作用;最后，构建TH启动子的截短载体结果证明在TH转录起始位点上游-2200～-2160区段内可能存在βFTZ-f1的结合位点。
　　综上所述，SEM品系适合度较SEW品系显著提高，是鲜有的实验室黑化昆虫适合度提高的案例;TH基因过表达是SEM品系形成的主要原因;βFTZ-f1和FTZ能够正向调节TH基因启动子活性，并且TH基因启动子区可能存在新的βFTZ-f1结合位点。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫黑化现象研究概况

1．1．1 昆虫黑化突变的生物学意义

1．1．2 黑色素生物合成基因在昆虫黑化中的作用

1．1．3 昆虫黑色素合成基因的转录调控方式

1．2 酪氨酸羟化酶基因的研究进展

1．2．1 哺乳动物和昆虫中酪氨酸羟化酶的异同点

1．2．2 酪氨酸羟化酶基因的调控机制

1．3 FTZ-f1转录因子研究进展

1．3．1 FTZ-f1转录因子的功能

1．3．2 FTZ-f1对靶基因的调控方式

1．3 甜菜夜蛾蛹黑突变的研究现状

1．4 本研究的意义和主要内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究内容

第二章 甜菜夜蛾蛹黑突变体形态观察及适合度变化研究

2．1 材料与方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 甜菜夜蛾人工饲料的配制及饲养条件

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 甜菜夜蛾化蛹图像采集

2．1．5 甜菜夜蛾蛹黑突变体实验种群生命表建立

2．1．6 甜菜夜蛾蛹黑突变体交配能力研究

2．1．7 黑化昆虫适合度变化相关因子分析

2．1．8 数据统计方法

2．2 结果与分析

2．2．1 甜菜夜蛾正常型及蛹黑型蛹色渐变图

2．2．2 甜菜夜蛾蛹黑突变体适合度变化

2．2．3 黑化昆虫适合度变化的决定性因子

2．3 讨论

第三章 甜菜夜蛾蛹黑型突变体形成的关键基因的克隆及功能鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 供试虫源

3．1．2 菌株和载体

3．1．3 主要仪器设备及耗材

3．1．4 实验试剂

3．1．5 常用试剂及培养基的配制

3．1．6 Trizol抽提甜菜夜蛾表皮组织总RNA

3．1．7 cDNA第一链合成

3．1．8 引物设计

3．1．9 RT-PCR

3．1．10 目的片段克隆

3．1．11 5’RACE和3’RACE

3．1．12 半定量RT-PCR

3．1．13 实时荧光定量PCR

3．1．14 序列分析及进化树构建

3．1．15 dsRNA合成及注射

3．1．16 酶抑制剂饲喂

3．1．17 数据统计方法

3．2 结果与分析

3．2．1 酪氨酸羟化酶基因片段克隆及表达量比较分析

3．2．2 多巴脱羧酶基因片段克隆及表达量比较分析

3．2．3 漆酶基因片段克隆及表达量比较分析

3．2．4 两品系酪氨酸羟化酶基因cDNA序列分析

3．2．5 昆虫酪氨酸羟化酶序列比对及进化树构建

3．2．6 酪氨酸羟化酶基因在化蛹前后的表达谱

3．2．7 干扰酪氨酸羟化酶基因对蛹色的影响

3．2．8 酪氨酸羟化酶抑制剂3-IT饲喂对蛹色的影响

3．2．9 两品系多巴脱羧酶基因cDNA序列分析

3．2．10 昆虫多巴脱羧酶序列比对及进化树构建

3．2．11 多巴脱羧酶基因在化蛹前后的表达谱

3．2．12 多巴脱羧酶抑制剂饲喂效果

3．3 讨论

第四章 酪氨酸羟化酶基因启动子克隆及分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试虫源

4．1．2 菌株和载体

4．1．3 主要仪器设备及耗材

4．1．4 实验试剂和试剂盒

4．1．5 常用试剂及培养基的配制

4．1．6 甜菜夜蛾基因组DNA提取

4．1．7 Genome Walking

4．1．9 巢式PCR

4．1．10 启动子序列分析

4．1．11 萤光素酶报告基因载体构建

4．1．12 酪氨酸羟化酶基因启动子5’ progressive deletion载体构建

4．1．13 细胞培养与转染步骤

4．1．14 细胞裂解与萤光素酶活性测定

4．1．15 数据处理和分析方法

4．2 结果与分析

4．2．1 酪氨酸羟化酶基因启动子调控元件预测

4．2．2 甜菜夜蛾酪氨酸羟化酶基因启动子活性元件定位

4．3 讨论

第五章 转录因子βFTZ-f1和FTZ对甜菜夜蛾酪氨酸羟化酶的调控

5．1 材料与方法

5．1．1 供试虫源

5．1．2 菌株和载体

5．1．3 主要仪器设备及耗材

5．1．4 实验试剂及试剂盒

5．1．5 常用试剂及培养基的配制

5．1．6 Trizol抽提甜菜夜蛾表皮组织总RNA

5．1．7 基因组DNA去除及cDNA第一链合成

5．1．8 引物设计

5．1．9 RT-PCR

5．1．10 Genome Walking

5．1．11 3’RACE

5．1．12 目的片段克隆

5．1．13 序列分析及进化树构建

5．1．14 半定量RT-PCR

5．1．15 实时荧光定量PCR

5．1．16 dsRNA合成

5．1．17 β-FTZ-f1和FTZ真核表达载体构建

5．1．18 定点突变和定点缺失载体构建

5．1．19 细胞培养与转染

5．1．20 细胞裂解与萤光素酶活性测定

5．1．21 核蛋白的抽提

5．1．22 凝胶阻滞实验

5．1．23 数据处理和分析方法

5．2 结果与分析

5．2．1 甜菜夜蛾转录因子βFTZ-f1 cDNA序列分析

5．2．2 昆虫βFTZ-f1序列比对及进化树构建

5．2．3 βFTZ-f1在化蛹前后的表达谱

5．2．4 βFTZ-f1对酪氨酸羟化酶基因启动子活性调节

5．2．5 dsRNA干扰βFTZ-f1对酪氨酸羟化酶基因启动子活性的影响

5．2．6 酪氨酸羟化酶基因启动子与βFTZ-f1的EMSA分析

5．2．7 βFTZ-f1与FTZ对酪氨酸羟化酶的共同调节

5．2．8 酪氨酸羟化酶基因启动子FTZ的EMSA分析

5．2．9 酪氨酸羟化酶基因启动子FTZ位点缺失与突变分析

5．2．10 酪氨酸羟化酶基因启动子区βFTZ-f1结合位点定位

5．3 讨论

第六章 结论和展望

6．1 主要结论

6．2 展望

6．3 论文创新点

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的论文

致谢