MiR156家族基因在柑橘阶段发育以及成花调控中的作用

摘要

MicroRNAs包括了miRNAs和siRNAs，是一类由21-24个碱基构成的具有保守结构域的非编码RNA。MicroRNAs在动植物中广泛存在且对其生长和发育具有重要的调控作用。MicroRNAs主要是通过靶定下游的相关基因，影响其转录后水平的表达来调控植物体的一系列生长发育过程。miR156是一种古老的MicroRNAs，在植物体中miR156具有高度保守的结构域。大量研究表明，miR156通过靶定SQUAMOSA-promoter binding-like(SPL)转录因子在植物的阶段发育和成花转变时期起到重要的调控作用。本实验室前期通过转录组测序得到了枳属中miR156的三个前体序列，分别是PtmiR156a、PtmiR156b和PtmiR156c。本研究分离了柑橘不同种属的3个miR156家族基因，并进行了序列分析。同时，采用STTM的方法构建了三个基因的干涉载体，转化普通枳和伏令夏橙愈伤，初步探究其在柑橘阶段发育和成花转变中所起的作用。得到结果如下:
　　1.在甜橙、普通枳和早实枳中分别克隆miR156家族基因，通过测序比对分析，其核心序列没有变化，而侧翼序列仅有个别碱基变化;通过对拟南芥、水稻和甜橙中miR156家族基因的克隆分析可知，在不同物种间，miR156的核心序列同源性很高而侧翼序列差别较大。这一结果表明:miR156家族基因在物种间的广泛存在且高度保守。
　　2.分别提取普通枳和早实枳不同年龄时期叶片以及成熟花器官的RNA，通过Real-time PCR检测了miR156家族基因在营养阶段和成花转变时期的表达量变化。结果表明:miR156家族基因在幼嫩叶片中表达很高，随着叶龄的增加而逐渐减少;而在成熟花器官的各部位中表达差异较大，表明miR156参与了年龄途径和成花转变，并在其中起到重要的调控作用。
　　3.采用了Short Tandem Target Mimic(STTM)的方法成功构建了35S∷PtmiR156a、156b、156c的干涉载体，转化普通枳和伏令夏橙愈伤，初步探究miR156家族基因的作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．前言

1．1 本课题的提出

1．2 MicroRNAs的发现、结构特征以及在生物体内的合成

1．3 植物MicroRNAs的研究进展

1．3．1 植物MicroRNAs参与的年龄途径

1．3．2 miR156家族基因在植物生长发育过程中的调控作用

1．4 已知miRNAs和siRNAs鉴定及差异分析的新方法

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 材料

2．1．2 质粒、试剂和菌株

2．1．3 实验主要试剂以及仪器

2．1．4 遗传转化培养基配方

2．2 方法

2．2．1 miR156家族基因的克隆和序列分析

2．2．2 MicroRNA-STTM干涉载体的构建

2．2．3 农杆菌介导的普通枳遗传转化

2．2．4 伏令夏橙愈伤的转化

2．2．5 RNA提取和Real-time PCR分析

3 结果与分析

3．1 miR156家族基因的克隆和比较

3．2 miR156靶基因SPL的分析

3．3 miR156在普通枳和早实枳阶段发育的Real-time PCR分析

3．3．1 RNA提取和反转录cDNA检测

3．3．2 miR156家族基因的Real-time PCR结果分析

3．4 miR156-STTM干涉载体的构建

3．5 miR156-STTM干涉载体转化伏令夏橙愈伤

3．5．1 伏令夏橙愈伤转化

3．5．2 转基因伏令夏橙愈伤的阳性鉴定

3．6 miR156-STTM干涉载体转化普通枳

4 讨论

4．1 miR156家族基因在植物中广泛存在和高度保守

4．2 miR156家族基因参与的植物生长发育

4．3 MicroRNA干涉载体的构建

4．4 研究展望

参考文献

附录

致谢