猪树突状细胞在猪链球菌2型感染致炎症风暴中的作用研究

摘要

猪链球菌病是由猪链球菌(Streptocuccus suis，SS)引起的对世界许多国家养猪业造成极大危害的人畜共患病。在已知的35种猪链球菌血清型中，毒性最强，研究最多的为猪链球菌2型(Streptocuccus suis serotype2，SS2)。我国有两次较大规模的2型猪链球菌病的爆发，分别发生在江苏省部分地区(1998)和四川省资阳地区(2005)，不仅对养猪业造成巨大经济损失，还导致了数百人感染、数十人死亡。
　　猪感染猪链球菌2型后在短时间内迅速出现脑膜炎、关节炎、肺炎等，严重的甚至死亡，表现出明显的炎症风暴症状。但目前对猪链球菌致病机理的研究多集中在脑膜脑炎的发生机制上，对猪链球菌侵入机体后如何导致炎症风暴，从而致死动物或人还不是十分清楚。树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是呈递抗原能力最强的抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APCs)。DC受不同类型抗原刺激后分泌不同类型的细胞因子，调节机体的炎症反应、诱导CD4+T细胞向不同的方向定向分化，在非特异性免疫应答和特异性免疫应答中发挥重要作用。然而，猪的DC在猪链球菌感染后产生的炎症风暴中是否发挥重要作用、以及发挥何种作用还少见报道。
　　为了研究DC在猪链球菌感染导致炎症风暴中的作用，本研究首先建立体外培养猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(Monocyte-derived DCs，MoDCs)的方法，依据树突状细胞共同特点，对目标细胞的形态、细胞膜表面标志、吞噬能力、刺激T淋巴细胞增殖能力进行检测，结果得到高质量的MoDC，为后续研究奠定了基础。接下来用猪链球菌2型野生菌株SC19刺激MoDC，检测MoDC分泌的细胞因子种类，重点考察促炎因子、抑炎因子、IL-12等的水平，为评价MoDC在炎症反应中的贡献及定向诱导何种Th亚型细胞分化提供依据。最后，将MoDC和CD4+T细胞混合在一起，用SC19刺激细胞混合物，获得CD4+T细胞定向分化的结果，为阐明MoDC在引发炎症风暴中的作用提供进一步的依据，主要研究内容及结果如下:
　　(1)成功建立了体外培养猪外周血MoDC的方法。采集猪前腔静脉的外周血，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，先分离到猪的外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells，PBMCs)，再通过免疫磁珠分选法分离到高纯度的CD14+的单核细胞，将CD14+的单核细胞用含有猪GM-CSF和猪IL-4的RPMI-1640培养液培养，并进行细胞形态显微镜观察、细胞膜表面标志流式检测、吞噬中性红能力检测、刺激T淋巴细胞增殖能力的检测，结果表明通过3～5d后得到大量高纯度半悬浮的猪MoDC。
　　(2)用SC19刺激培养至5d的MoDC，细胞流式表型分析显示MoDC的CD1和CD172a表达下降，吞噬中性红的能力降低，刺激T淋巴细胞增殖能力增强，表明SC19可以刺激MoDC的成熟，且MoDC存在自发成熟的现象。受SC19刺激后，MoDC分泌高水平IL-1β、IL-8、TNF-α、IFN-γ等促炎性细胞因子，分泌低水平IL-10、TGF-β抑炎性细胞因子，分泌很高水平的IL-12，其中IL-8和IL-12的分泌水平呈现明显的SC19剂量依赖性。MoDC分泌高水平IL-12的结果提示SC19刺激MoDC后会诱导CD4+T向Th1亚型分化。
　　(3)为进一步验证SC19刺激MoDC确实会诱导CD4+T向Th1亚型分化，将培养5d的MoDC与新分离的CD4+T细胞混合，加入SC19刺激，17h后流式检测Th亚型，结果显示Th1亚型细胞数量上升比Th2亚型明显;蛋白质芯片检测混合细胞培养上清细胞因子，Th1效应性细胞因子IFN-γ明显增加;表明SC19刺激的MoDC诱导CD4+T向Th1亚型分化。
　　以上研究结果提示:MoDC在猪链球菌感染引发炎症风暴中发挥重要作用，主要通过分泌高水平的促炎因子及IL-12、IL-12诱导分化出的Th1细胞及其分泌的细胞因子发挥作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 猪链球菌病流行病学

1．2．2 猪链球菌相关毒力因子

1．2．3 猪链球菌病临床症状和病理变化

1．2．4 炎症风暴

1．2．5 树突状细胞

1．2．6 T淋巴细胞

1．2．7 CD4+T细胞

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 实验动物

2．2 主要实验试剂

2．3 主要实验仪器

2．4 其他试剂的配制

2．5 实验方法

2．5．1 猪链球菌的培养和处理

2．5．2 猪外周血MoDC的分离和诱导培养

2．5．3 猪外周血MoDC的流式鉴定

2．5．4 SC19刺激的猪外周血MoDC表型流式分析

2．5．5 SC19刺激的猪外周血MoDC吞噬能力检测

2．5．6 SC19感染的猪外周血MoDC刺激T淋巴细胞增殖能力检测

2．5．7 SC19刺激的猪外周血MoDC分泌细胞因子的检测

2．5．8 猪外周血源CD4+T细胞的分选与纯度鉴定

2．5．9 SC19刺激猪外周血MoDC诱导CD4+T细胞定向分化流式分析

2．5．10 SC19刺激猪外周血MoDC诱导CD4+T细胞分泌细胞因子的检测

2．5．11 实验数据处理和分析

3 结果与分析

3．1 猪外周血单个核细胞层的分离和MoDC的培养

3．2 猪MoDC的流式鉴定

3．3 SC19刺激MoDC后表型流式分析

3．4 SC19刺激MoDC后吞噬能力变化

3．5 SC19感染的MoDC刺激T淋巴细胞增殖能力

3．6 SC19刺激的MoDC分泌的细胞因子

3．7 免疫磁珠分选的猪外周血源CD4+T细胞的纯度

3．8 SC19刺激MoDC诱导CD4+T细胞定向分化流式分析

3．9 SC19刺激MoDC和CD4+T细胞分泌的细胞因子

4 讨论

4．1 猪链球菌与猪链球菌病

4．2 猪外周血MoDC的培养

4．3 SC19刺激对猪MoDC细胞表型影响

4．4 SC19刺激对猪MoDC吞噬功能的影响

4．5 SC19感染对猪MoDC刺激T淋巴细胞增殖能力的影响

4．6 SC19刺激的MoDC对CD4+T细胞定向分化的影响

4．7 DC在猪链球菌感染导致炎症风暴过程中的作用分析

5 结论

参考文献

致谢