TLR3与RIG-I相关信号分子在鸭呼肠孤病毒感染雏鸡免疫器官中表达变化研究

摘要

鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus，DRV)感染雏鸭后，主要侵害雏鸭免疫系统，如脾、法氏囊、胸腺，引起雏鸭免疫器官损伤，从而继发其它细菌感染。天然免疫系统中有很多模式识别受体可以识别病毒核酸，从而激活机体的抗病毒反应。TLR3和RIG-Ⅰ可以特异性的识别侵入机体的双链RNA病毒，激活下游的信号分子，最终诱导IFNβ的释放，引起抗病毒免疫反应。目前，对鸭呼肠孤病毒诱导抗病毒反应的信号通路还不明确，本研究通过病毒感染动物模型的复制，研究鸭呼肠孤病毒感染雏鸭后两条抗病毒反应信号通路中相关分子的mRNA表达变化，初步阐明病毒引起的主要抗病毒天然免疫信号途径。主要研究内容如下:
　　1.鸭呼肠孤病毒感染雏鸭模型的复制将30羽樱桃谷雏鸭随机均分为感染组和对照组两组，于雏鸭7日龄对感染组雏鸭颈部皮下注射鸭呼肠孤病毒（HP20090318株）0.2mL/羽，对照组注射等量的生理盐水。分别于接毒后1d、3d、5d、7d、14d进行剖杀，每组剖杀3羽。眼观病理学观察，接毒后1d和3d雏鸭脾表面分布有大小不一的红色斑点，5d和7d雏鸭脾表面分布有灰白色病灶病灶周围有红色斑点;法氏囊与胸腺未见明显眼观病变。组织病变可见接毒后1d和3d脾组织内出现大量红细胞，红髓、白髓界限不清，接毒后5d和7d在组织内出现坏死灶及肉芽肿;感染组法氏囊淋巴滤泡数目减少，出现空泡;胸腺组织内未见明显病变。用免疫组化染色结果显示鸭呼肠孤病毒存在于脾巨噬细胞以及坏死灶中。RT-PCR检测鸭呼肠孤病毒S2基因，发现在接毒后1d、3d、5d、7d以及14d感染组雏鸭脾均有DRV存在。上述结果表明鸭呼肠孤病毒感染雏鸭模型复制成功。
　　2.TLR3、TRIF、IRF3、RIG-Ⅰ、IFNβ信号分子mRNA表达变化检测(1) TLR3抗病毒信号通路中，TLR3与其直接激活的TRIF在机体内表达水平在接毒后1d、3d、5d、7d以及14d表达差异不明显，在脾、胸腺与法氏囊三个组织中，法氏囊内各信号分子的表达水平高于脾和胸腺。IRF3是TLR3信号通路与RIG-Ⅰ信号通路中共同的中间分子，其在脾与法氏囊中接毒后3d的相对表达水平与接毒后1d相比上升明显，接毒后5d、7d以及14d相对表达水平逐渐下降但与接毒后1d相比差异不明显，并且在不同感染日龄法氏囊内的相对表达水平均高于相应日龄的脾;IRF3在胸腺组织中接毒后1d表达明显上调，其他日龄上调不明显。
　　(2)RIG-Ⅰ抗病毒信号通路中RIG-Ⅰ的表达水平要高于TLR3信号分子;其中在法氏囊内的表达水平高于脾和胸腺，在接毒后3d、5d表达水平最高。
　　(3)IFNβ是两条信号通路的最终激活因子，并介导抗病毒效应，其在脾、胸腺与法氏囊三个组织中的相对表达水均呈现上调趋势，接毒后3d和5d相对表达水平上调。同样在法氏囊内的相对表达水平要高于脾和胸腺两组织。
　　本研究结果表明:成功复制了鸭呼肠孤病毒HP20090318株感染雏鸭动物模型;鸭呼肠孤病毒进入雏鸭体内主要由RIG-Ⅰ进行识别，为主要的抗病毒反应通路;在脾、法氏囊和胸腺三个组织中，法氏囊内各信号分子的表达水平要高于脾和胸腺，推测法氏囊在抗鸭呼肠孤病毒的作用中发挥着主要功能。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

1 鸭呼肠孤病毒的损伤机制研究进展

1．1 鸭呼肠孤病毒的致病特点

1．2 鸭呼肠孤病毒的病原结构特征

2 模式识别受体

2．1 TLRs概述

2．2 TLR3激活抗病毒反应途径

2．3 RLRs概述

2．4 RIG-I激活抗病毒反应途径

研究的目的及意义

材料和方法

1 实验材料

1．1 病毒

1．2 细胞

1．3 实验动物

1．4 参考序列

1．5 主要试剂

1．6 主要实验耗材

1．7 主要仪器设备

1．8 主要溶液及其配制

2 实验方法

2．1 动物感染及样品采集

2．2 实验动物的病理学观察

2．3 实验动物体内鸭呼肠孤病毒的检测

2．4 感染动物TLR3与RIG-I信号通路表达水平检测

2．5 数据的统计分析

结果与分析

1 鸭呼肠孤病毒HP09318株动物模型复制结果

1．1 鸭呼肠孤病毒的增殖与纯化结果

1．2 临床表现与眼观病变

1．3 组织学病理变化

1．4 鸭呼肠孤病毒脾组织内定位

1．5 鸭呼肠孤病毒S2基因的扩增

2 TRL3与RIG-I信号通路相关分子荧光定量检测结果

2．1 RT-PCR检测β-actin和TLR3信号通路相关基因结果

2．2 RT-PCR检测β-actin和RIG-I结果

2．3 接毒后脾、法氏囊和胸腺内TLR3的表达水平变化

2．4 接毒后脾、法氏囊和胸腺内TRIF的表达水平变化

2．5 接毒后脾、法氏囊和胸腺内IRF3的表达水平变化

2．6 接毒后脾、法氏囊和胸腺内RIG-I的表达水平变化

2．7 接毒后脾、法氏囊和胸腺内IFNβ的表达水平变化

讨论

1 人工感染动物模型的复制

2 雏鸭感染DRV后机体内TLR3介导的抗病毒反应

3 雏鸭感染DRV后机体内RIG-I介导的抗病毒反应

4 雏鸭感染DRV后机体内IRF3与IFNβ在机体内的作用

结论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文