水稻代谢数量性状位点研究及代谢相关基因克隆

摘要

植物代谢物对植物生长发育、适应环境和人类营养等都非常重要。水稻是世界上主要的粮食作物之一，同时也是单子叶植物的模式生物。对水稻代谢组进行遗传分析，鉴定代谢相关的基因功能，进一步解析代谢途径，有利于改善水稻对环境胁迫的适应性、改良稻米品质、提高水稻产量。
　　代谢数量性状位点(mQTL)的研究是以代谢物的积累水平作为数量性状进行QTL定位，分析控制代谢物含量变异的遗传位点。本论文主要利用以珍汕97和明恢63为亲本构建的重组自交系(RIL)群体，对不同组织和不同时期的材料进行代谢取样，以一种广泛定向代谢组的分析方法进行了检测;以基于重组bin标记的高密度遗传连锁图进行了mQTL定位，获得了大量定位区间小、解释效应大的mQTL;用导入系(IL)对mQTL结果进行了验证;将不同水平的组学数据进行整合，辅以生物信息学分析的手段，筛选了一批控制代谢性状的候选基因，并对部分基因进行了功能验证;对水稻中相关的代谢途径进行了重构和完善。本论文主要结果如下:
　　1.检测方法的验证以本室建立的基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)平台的研究方法，对RIL群体的亲本ZS97、MH63和部分种质资源进行了检测，结果表明该方法能很好地用于实验材料的分类，能同时检测近一千种代谢物，具有很好的稳定性和准确性，可以进一步用于水稻群体大规模、高通量的代谢组分析。
　　2.不同组织的mQTL研究在水稻抽穗期剑叶和发芽72 h种子中分别检测了683个和317个代谢物，其中100个是两个组织共同检测到的。以1，619个重组bin标记构建的高密度遗传连锁图进行mQTL定位，剑叶中的617个代谢性状共定位到1，884个mQTL，发芽种子中的302个代谢性状共定位到837个mQTL，两个组织都定位到一些置信区间很小和解释效应很大的位点。对两个组织中共同检测的代谢物及其定位到的mQTL进行比较分析，发现代谢物的积累模式在不同组织间存在很大差异，代谢物的含量也存在着复杂的遗传调控模式。
　　mQTL并不是随机分布在各个染色体上，在剑叶的第1、第6、第7、第10染色体和发芽种子的第5、第6染色体上出现了明显的富集。以1 cM为窗口统计每个区间内mQTL的数目，在剑叶和发芽种子中分别鉴定了44个和16个mQTL热点。选取最靠近mQTL热点的重组bin，对所有已知物质进行两位点互作分析，发现了代谢性状的调控中存在显著的两位点互作。以ZS97为受体，MH63为供体的ILs，检测了64个代谢物，其中有55个代谢物的主效mQTL的效应得到了证实。结合基因组、转录组的数据，筛选了24个候选基因（9个为新基因），包括一些控制重要农艺性状和生物学过程的基因，并在此基础上重构和完善了水稻相关的代谢途径。
　　3.不同时期的mQTL研究对水稻三个不同发育时期的种子进行了代谢组检测。在成熟期种子、发芽72 h种子和灌浆期种子中分别获得了810，836和855个代谢物的数据，其中372个为三个时期共同检测过的物质。三个时期中都有一半以上的代谢性状的变异系数超过50％，表明RIL群体不同发育时期种子的代谢组都存在很大差异。在成熟种子、发芽种子和灌浆种子分别定位到了1，506，1，575和1，600个mQTL，并分别检测到42个、39个和39个mQTL热点。
　　比较三个时期共同检测的372个代谢物，发现各类别的代谢物在不同时期都表现出不同的紧密程度。分析这372个代谢物的mQTL，成熟种子中有303个物质定位了共746个mQTL，发芽种子中有311个物质定位了共692个mQTL，灌浆种子中有290个物质定位了共629个mQTL，然而这其中只有57个mQTL在三个时期中定位是相同的。代谢性状的定位结果多种多样，其中有95个代谢性状在三个时期都能定位到mQTL但位点却完全不同，表明了代谢组的遗传调控存在非常强的时期特异性。结合基因组、转录组的数据，分析代谢物和定位的mQTL结果，筛选到33个候选基因。
　　4.代谢相关基因克隆利用体内转基因材料验证了两个酰基转移酶(已报道的OsMaT-2和新鉴定的OsMaT-3)对黄酮类物质m0723-L含量的调控作用，和一个糖基转移酶LOC_Os11g26950对黄酮类物质m0760-L含量的调控作用。比较了未知物质m0434-L(m/z427/397)在RIL群体和自然群体中的结果，两者的定位结果非常接近，而且都非常显著;对其候选基因LOC_Os03g25500在种质资源中进行了比较测序和代谢检测，揭示了一个功能性的SNP位点（该位点在MH63中编码谷氨酸，而在ZS97中为终止密码），但该未知物质的结构解析和候选基因的功能验证还有待于深入研究。代谢物m0447-L的一个微效mQTL在自然群体中的定位结果非常显著(P=4.6×10-33）;通过体内转基因实验证实了其候选基因LOC_Os07g32060对m0447-L含量的调控作用，其它26个相关代谢物的检测结果表明该基因特异性控制黄酮葡萄糖苷5号位的氧糖基化修饰。
　　本论文的结果加深了我们对水稻代谢组的遗传和生化基础的理解，有助于搭建基因组和表型组之间的桥梁，为水稻遗传改良提供新的资源和方向。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 代谢组概述

1．2．2 代谢数量性状

1．2．3 代谢数量性状定位群体

1．2．4 分子标记

1．2．5 代谢数量性状分析

1．2．6 mQTL研究进展

1．2．7 代谢性状和mQTL的特异性

1．2．8 代谢途径和调控网络

1．2．9 系统性的遗传基因组研究

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 菌株和载体

2．2 实验方法

2．2．1 田间种植

2．2．2 代谢样品取样

2．2．3 代谢样品检测

2．2．4 代谢性状数据分析

2．2．5 mQTL定位

2．2．6 两位点互作分析

2．2．7 测序及序列拼接

2．2．8 载体构建

2．2．9 遗传转化

2．2．10 RNA抽提、RT-PCR和Real-time PCR

3 结果与分析

3．1 广泛定向检测水稻代谢组的方法

3．2 水稻抽穗期剑叶和发芽72h种子的mQTL研究

3．2．1 抽穗期剑叶和发芽72h种子的代谢组

3．2．2 代谢性状的分布与统计

3．2．3 mQTL定位

3．2．4 mQTL分布

3．2．5 两位点互作分析

3．2．6 mQTL定位结果验证

3．2．7 筛选候选基因

3．2．8 构建代谢途径

3．3 水稻不同发育时期种子的mQTL研究

3．3．1 三个发育时期种子的代谢组检测

3．3．2 代谢性状统计及mQTL定位

3．3．3 mQTL的分布

3．3．4 三个时期的比较分析

3．3．5 筛选候选基因

3．4 水稻代谢相关基因克隆

4 讨论

4．1 检测方法的拓展

4．2 定位群体的局限性

4．3 寻找更多的mQTL热点

4．4 候选基因的克隆与应用

4．5 代谢性状与其它类型性状的联系

5 展望

参考文献

附录

作者简介

致谢