基于RNA-seq的丛枝菌根真菌Gigaspora rosea基因构成及其共生发育相关基因的分析

摘要

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF）可与地球上大多数植物根系形成一种独特的互惠共生体——丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)。AM可以显著改善宿主植物的营养、水分代谢及其抗逆性，因而对现代可持续农业具有重要意义。AMF属于专性活体营养型(Obligate biotrophy)生物，其生物学及遗传学复杂性极大的限制了人们对其发育的分子生物学机制研究。尽管模式种Rhizophagus irregularis组学数据的发布为我们了解AMF遗传组成的全貌打开了第一扇门，然而AMF作为一支独立而古老的真菌进化分支（Glomeromycota，球囊菌门)，其中包含了丰富的遗传多样性和生理生态多样性，因而R.irregularis组学数据所呈现出来的特点能否代表整个AMF类群的普遍特征目前还不得而知。为了更全面地了解AMF遗传构成的特点和探索其共生发育的分子生物学机制，本研究选取一个在遗传和生理生态特征上与模式种R.irregularis(Glomerales)有着显著差异的菌根真菌物种Gigaspora rosea(Diversisporales)作为研究对象，采用二代核酸测序技术(RNA-sequencing)及相关生物信息学分析技术，对其转录组结构和功能进行了全面的研究，主要结果如下:
　　1.针对G.rosea的生理特征，本研究优化了相关实验方法并运用这些方法成功制备了高质量、能代表各个典型发育阶段的高通量测序核酸(RNA)样本，克服了以往AMF分子生物学研究尤其是大规模组学研究中一直存在的AMF核酸含量不足和质量不高的问题。
　　2.运用CLC genomics workbench软件对高通量测序所得的读段序列(reads)进行分类和从头拼接(de novo assembly)，得到86332个非冗余G.rosea虚拟转录本序列，平均长度643bp。通过与Refseq蛋白质数据库比对，只有15346个转录本可以被注释成数据库中已知基因，表明AMF中存在着大量的家系特异的孤儿基因（Lineage-specific orphan genes）。蛋白质功能注释（GO和KOG）及与其他不同类群的真菌比较显示AMF中显著富集了大量的信号转导相关基因，这表明其与宿主植物互作过程中可能涉及密集的信号交换过程。全局性代谢通路(KEGG)分析结果表明AMF仍保留了绝大多数的初级代谢基因，而缺失的少数代谢基因可能造成了AMF的专性活体营养特性。AMF中重要生理特性相关基因的深度注释表明AMF的基因构成具有一些不同于其他类群真菌的鲜明特点，这在很大程度上反映了它们特殊的生理生态学特征和进化优势。基于多基因比对的系统发育关系研究(phylogenomics)清晰地表明了AMF与毛霉亚门(Mucoromycotina)真菌关系更近，而非之前所认为的双核亚界真菌。
　　3.通过比较根内共生发育阶段和根外菌丝阶段的转录组发现G.rosea在根内发育过程中有上千个转录本出现显著的差异表达。其中上调表达的基因主要涉及氧化还原过程(oxidation-reduction process)、蛋白质水解(proteolysis)、跨膜转运（transmembrane transport）等过程。通过比较进化距离遥远的两种宿主植物共生条件下G.rosea转录组的异同发现，G.rosea基因在不同宿主中的表达调控表现出异乎寻常的一致性:有将近一半的基因出现了相似的表达模式。这种一致性说明G.rosea很可能采用了一种非常保守的基因表达调控策略来实现其对所有宿主植物的侵染和定殖。此外，通过与亲缘关系较远的模式种R.irregularis的转录组数据比较分析本文还发现了四十多个表达模式高度保守的AMF基因:这些基因在不同AMF种类、不同宿主植物种类中都呈现明显上调。这些表现出保守表达模式的G.rosea核心基因的注释表明分泌性蛋白(Secretedprotein)介导的信号转导、转运蛋白(Transporter)介导的营养交换、脂肪酸链延长及修饰相关酶类介导的脂类合成等过程在AM共生的建立过程可能发挥着非常核心的作用。
　　在AMF组学数据仍然十分有限的情形下，这些研究结果不仅为将来的AMF基因功能研究提供了海量的基因数据资源，也为Glomeromycota类群内部及其与其他真菌的比较基因组或转录组学研究提供了可能。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 丛枝菌根概述

1．2 丛枝菌根的发育

1．2．1 非共生时期(asymbiotic stage)

1．2．2 前共生时期(presymbiotic stage)

1．2．3 共生建立时期(symbiotic stage)

1．3 丛枝菌根真菌研究进展

1．3．1 丛枝菌根真菌生物学与遗传学特性

1．3．2 丛枝菌根真菌的分类及多样性

1．3．3 丛枝菌根真菌基因研究进展

1．4 转录组学研究方法概述

1．4．1 基因表达系列分析(SAGE)法和大规模平行标签测序(MPSS)法

1．4．2 基因芯片法(gene chip)

1．4．3 RNA测序法(RNA-sequencing)

1．5 菌根真菌转录组学研究现状

1．6 本课题的研究目标及内容

1．6．1 本课题的选题背景和研究目的

1．6．2 本课题的研究内容

第二章 G.rosea各发育阶段生物样品的制备及RNA测序

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种和宿主植物

2．2．2 主要试剂和培养基质

2．2．3 主要仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 不同发育阶段Gigaspora rosea生物材料的培养

2．3．2 总RNA的提取和质量检验

2．3．3 RNA测序文库的构建及上机测序

2．4 结果与讨论

2．4．1 各发育阶段G.rosea生物样品的获得

2．4．2 生物样品中RNA样品的提取及质量评估

2．4．3 RNA测序文库的构建及测序

2．5 本章小结

第三章 G.rosea转录组的拼接、全局注释及系统发育分析

3．1 引言

3．2 用于分析的原始数据及软件程序

3．2．1 用于分析的原始数据

3．2．2 用于分析的软件程序

3．3 数据分析方法

3．3．1 原始测序数据的过滤和分类

3．3．2 G.rosea转录组的从头拼接、完善及质量评价

3．3．3 G.rosea转录组中SNPs和SSRs分子标记的鉴别

3．3．4 G.rosea转录组的全局功能注释

3．3．5 G.rosea及其他真菌的系统发育分析方法(phylogenomics)

3．4 结果与讨论

3．4．1 原始测序数据的过滤和分类

3．4．2 G.rosea转录组的拼接及质量评估

3．4．3 G.rosea转录组中SNP和SSR分子标记的鉴定

3．4．4 G.rosea转录组的全局功能注释

3．4．5 AMF及其他真菌的进化分析

3．5 本章小结

第四章 G.rosea中重要生理特性相关基因的深度注释

4．1 引言

4．2 用于分析的原始数据及相关软件和程序

4．2．1 原始数据

4．2．2 软件和程序

4．3 数据分析方法

4．3．1 G.rosea重要基因的深度注释方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 CAZymes酶的注释

4．4．2 分泌蛋白质组(secretome)的注释

4．4．3 转运蛋白(transporter)基因的注释

4．4．4 有性生殖相关基因的注释

4．5 本章小结

第五章 G.rosea共生发育阶段转录组差异表达分析

5．1 引言

5．2 原始数据和分析方法

5．2．1 原始数据

5．2．2 分析方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 用于表达差异分析的G.rosea样品各生物学重复之间均一性评价

5．3．2 G.rosea差异表达基因的获得及功能分析

5．4 本章小结

第六章 结论

参考文献

附录

致谢