大蒜精油活性物质干扰麦蛾交配的分子机理研究

摘要

麦蛾Sitotroga cerealella Olivier是一种世界性储粮害虫，在小麦和水稻储存中发生尤为严重。在我国某些地区，仅麦蛾所造成的储粮损失可占总损失量的40％以上。目前，化学防治仍是防治储粮害虫的主要有效手段，但麦蛾以幼虫钻蛀为害的特性使其不能直接接触化学农药，大大降低了防治效率，而且化学防治还存在着害虫抗性提高和化学残留等问题，因此寻求一种安全有效的环境友好型的绿色谷物保护剂已迫在眉睫。
　　本课题组前期研究发现大蒜精油及其两种主要活性成分（二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚）能显著降低麦蛾的产卵量，但对于大蒜精油及其活性物质抑制麦蛾产卵的作用机制至今尚未明确。另外，本课题组其他研究人员发现，大蒜精油活性物质可显著降低麦蛾的交配率和交配频率，由此我们推测大蒜精油活性物质可能是通过干扰麦蛾的交配行为，从而抑制雌蛾的产卵量。根据昆虫气味识别机制，我们进一步推测麦蛾触角中的气味结合蛋白在大蒜精油活性物质对麦蛾的交配干扰行为反应中起着重要的作用。因此，本研究主要从昆虫的气味识别机制来阐明大蒜精油活性物质干扰麦蛾交配的作用靶标和分子机制。结果如下:
　　1.大蒜精油活性物质对麦蛾嗅觉行为的影响
　　利用Y型嗅觉仪监测了大蒜精油活性物质对麦蛾嗅觉行为反应的影响，研究结果表明:10μL剂量的二烯丙基三硫醚对麦蛾雌虫(RI=0.08; P＞0.05)和雄虫(RI=0.03;P＞0.05)均无显著的行为影响;10μL剂量的人工合成雌虫性信息素（顺7，反11-十六碳双烯-1-醇乙酸酯）对雄虫具有极显著的诱集效果(RI=-0.49;P＜0.001)，对雌虫具有极显著的驱避活性(RI=0.64;P＜0.000001);但当相同剂量的人工合成雌虫性信息素与二烯丙基三硫醚同时存在时，人工合成雌虫性信息素对雄虫没有了显著的引诱活性(RI=-0.10;P＞0.05)，对雌虫的驱避率也显著地降低了(RI=0.31; P＜0.05)。另外，麦蛾对二烯丙基二硫醚的嗅觉行为反应与二烯丙基三硫醚一致。这可能是由于大蒜精油活性物质干扰了麦蛾对人工合成雌性信息素的感知能力。
　　2.麦蛾触角感器的超微结构观察
　　采用扫描电镜和透射电镜，研究了麦蛾雌雄成虫触角感器的超微结构。结果发现:在麦蛾触角中共有7种类型的感受器，即毛形感器、锥形感器、腔锥形感器、栓锥形感器、耳形感器、鳞形感器和B(o)hm氏鬃毛，其中雄虫的长毛形感器显著多于雌虫。根据昆虫触角感器的形态、构造、分布和数量，并结合相关文献，作者分析并讨论了这些感器的功能。其研究内容将有利于我们更深入地了解麦蛾雌雄虫间化学信息交流机制，为进一步探索麦蛾的嗅觉行为提供理论依据。
　　3.麦蛾气味结合蛋白基因的克隆和表达模式分析
　　通过RT-PCR和RACE技术首次获得了麦蛾3个气味结合蛋白基因的全长:ScerGOBP1(登录号:KF513152)，ScerGOBP2(登录号:KF513150)和ScerPBP（登录号:KF513151）。通过序列分析和qRT-PCR检测发现这3个基因都具有气味结合蛋白的典型特征:分子量较小，低等电点，亲水性，N端具有信号肽，具有6个保守的半胱氨酸残基，并且只在触角中特异性表达。其中，ScerGOBP1和ScerGOBP2在雌雄中表达量相当;而ScerPBP在雄虫中的表达量显著高于雌虫。另外，雄虫触角中ScerPBP的表达丰度明显高于ScerGOBP1和ScerGOBP2。本研究结果为麦蛾气味结合蛋白结构和功能研究奠定了基础。
　　4.麦蛾气味结合蛋白的表达纯化和结合特性分析
　　通过原核表达和亲和层析纯化体外获得大量麦蛾气味结合蛋白，利用荧光竞争结合实验来研究大蒜精油活性物质/麦蛾性信息素与ScerOBPs之间的结合能力。结果表明二烯丙基三硫醚与ScerPBP之间有很强的结合能力，甚至比性信息素与该蛋白之间的结合能力还要强;但二烯丙基三硫醚与ScerGOBP1和ScerGOBP2的结合能力很弱。同时，二烯丙基二硫醚与ScerOBPs之间的结合特性亦表现出与二烯丙基三硫醚相似的结果，但是其结合能力较弱于二烯丙基三硫醚。以上研究结果表明大蒜精油活性物质可能是通过与性信息素竞争结合ScerPBP，减少了雄虫触角中的ScerPBP与雌虫释放出的性信息素的结合机会，从而最终干扰了麦蛾的交配行为。
　　5.麦蛾信息素结合蛋白的同源模建及分子对接
　　通过同源模建方法构建ScerPBP的三维结构，并利用分子对接技术模拟大蒜精油活性物质/麦蛾性信息素与ScerPBP之间的相互作用方式。ScerPBP的三维模型含有6个α-螺旋结构，这些α-螺旋紧密排列形成一个结合口袋。分子对接结果显示两种大蒜精油活性成分（二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚）和麦蛾性信息素均可与ScerPBP成功对接，并且共享一个疏水性结合腔，进一步表明大蒜精油活性物质可能是麦蛾性信息素的结合抑制剂，可以与性信息素竞争结合ScerPBP。
　　总之，通过以上的研究，作者初步明确了大蒜精油活性物质干扰麦蛾交配行为的分子机制:大蒜精油活性物质通过与性信息素竞争结合ScerPBP，减少了雄虫触角中的ScerPBP与雌虫释放出的性信息素的结合机会，从而最终干扰了麦蛾的交配行为，减少了雌蛾的产卵量。该研究结果揭示了麦蛾感受和识别环境中的气味物质并产生相应行为反应的分子机制，同时亦为麦蛾的防治提供了新的靶标和思路。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 麦蛾的危害及其防治研究进展

1．1 麦蛾对粮食的危害

1．2 麦蛾的防治对策

2 交配干扰技术在害虫治理中的研究进展

2．1 应用于交配干扰技术的化学物质

2．2 基于性信息素的交配干扰的作用机制

2．3 交配干扰防治技术的应用及前景

3 大蒜精油主要化学成分及其生物活性研究进展

3．1 大蒜精油的主要化学成分

3．2 大蒜精油的抑菌和杀虫活性

3．3 大蒜精油的药理活性

4 昆虫气味结合蛋白研究进展

4．1 气味结合蛋白的分子特征和三维结构

4．2 气味结合蛋白的表达模式

4．3 气味结合蛋白的生理功能

4．4 气味结合蛋白的结合特性研究方法

5 研究内容及技术路线

6 研究目的和意义

第二章 大蒜精油活性物质对麦蛾嗅觉行为的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 主要试剂

2．3 嗅觉反应生物测定

2．4 统计分析

3 结果与分析

3．1 二烯丙基三硫醚对麦蛾嗅觉行为的影响

3．2 二烯丙基二硫醚对麦蛾嗅觉行为的影响

4 讨论

第三章 麦蛾触角感器的超微结构观察

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 扫描电镜样品制备

2．5 透射电镜样品制备

3 结果与分析

3．1 麦蛾触角的一般形态

3．2 触角感器的种类、形态和分布

4 讨论

第四章 麦蛾气味结合蛋白基因的克隆和表达模式分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器设备

2．4 引物设计

2．5 RNA提取

2．6 反转录

2．7 简并PCR克隆OBPs基因片段

2．8 PCR产物回收、连接转化和克隆测序

2．9 3’和5’RACE克隆OBPs全长基因

2．10 序列分析

2．11 麦蛾OBPs基因的表达模式分析

3 结果与分析

3．1 麦蛾OBPs基因保守片段的克隆与分析

3．2 麦蛾OBPs基因全长克隆与分析

3．3 麦蛾OBPs基因的表达模式分析

4 讨论

第五章 麦蛾气味结合蛋白的表达纯化和结合特性分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 载体与菌株

2．2 主要试剂

2．3 主要溶液配制

2．4 原核表达引物设计

2．5 成熟ScerOBPs基因克隆和序列鉴定

2．6 构建表达载体

2．7 目的蛋白诱导表达鉴定

2．8 诱导条件优化

2．9 目的蛋白大量诱导表达

2．10 目的蛋白纯化

2．11 荧光竞争结合实验

3 结果与分析

3．1 麦蛾气味结合蛋白原核表达载体的构建

3．2 原核表达诱导条件优化

3．3 麦蛾气味结合蛋白的大量表达和纯化

3．4 荧光竞争结合实验分析ScerOBPs的结合特性

4 讨论

第六章 麦蛾信息素结合蛋白的同源模建及分子对接

1 前言

2 材料与方法

2．1 同源模建

2．2 分子对接

3 结果与分析

3．1 ScerPBP的同源模建

3．2 配体与ScerPBP的分子对接

4 讨论

第七章 总结与展望

1 总结

1．1 大蒜精油活性物质对麦蛾嗅觉行为的影响

1．2 麦蛾触角感器的超微结构观察

1．3 麦蛾气味结合蛋白基因的克隆和表达模式分析

1．4 麦蛾气昧结合蛋白的表达纯化和结合特性分析

1．5 麦蛾信息素结合蛋白的同源模建及分子对接

2 展望

3 创新点

参考文献

攻读博士学位期间的研究成果

致谢