农杆菌介导柑橘指状青霉遗传转化体系的优化及其致病机理的初步研究

摘要

指状青霉是造成柑橘果实采后损失最严重的病原菌。因此，研究其致病机理，有效防治指状青霉引起的病害是很有必要的。本实验通过对农杆菌介导指状青霉转化的体系进行优化，稳定高效地获得大量突变转化子，建立指状青霉突变体库。同时，对已获得的转化子进行比较分析，获得了一株不使柑橘果实发病的突变菌株，对该菌株进行了分子分析（PCR分析、Tail-PCR分析、Southern blot等），找出T-DNA插入位点，通过RNAi技术探究突变位点的基因与指状青霉致病性的关系。主要的实验结果如下:
　　1.优化了农杆菌介导的柑橘指状青霉转化条件:硝酸纤维素膜(NC膜)为承载膜，农杆菌浓度OD600=0.6～0.8，指状青霉孢子浓度为2×106CFU/ml，共培养时25℃恒温培养48h。此时的转化效率最高，能达到约20-50个转化子/皿。建立了含有一千多个转化子的指状青霉突变体库。
　　2.通过接种已获得的转化子于柑橘果实上，进行对比分析，获得了一株不使柑橘发病的菌株，通过Southern blot、Tail-PCR实验，找到了两个T-DNA插入位点。
　　3.针对两个突变基因，通过RNAi技术初步研究了其与指状青霉致病性的关系，但还需进一步研究。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 柑橘主要采后真菌病害

1．2 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展

1．2．1 农杆菌介导丝状真菌转化的基本原理

1．2．2 农杆菌介导转化法在丝状真菌研究中已有的进展

1．2．3 农杆菌介导转化的特点

1．2．4 影响农杆菌介导丝状真菌转化效率的因素

1．2．5 农杆菌介导转化在丝状真菌研究中的应用前景

1．3 RNAi技术在基因功能研究上的进展

1．3．1 RNAi技术的发现

1．3．2 RNAi技术在真菌基因功能上的研究进展

1．3．3 RNAi技术的特点

1．3．4 RNAi技术在真菌中的应用前景

1．4 研究的目的及意义

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌种，质粒及其来源

2．1．2 主要培养基和抗生素

2．1．3 其他试剂及材料

2．2 试验方法

2．2．1 指状青霉对抗生素的敏感性检测

2．2．2 农杆菌介导指状青霉转化

2．2．3 转化子的稳定性及分子检测

2．2．4 转化子的致病力检测

2．2．5 Southern blot确定转化子T-DNA插入拷贝数

2．2．6 Tail-PCR、hi Tail-PCR扩增T-DNA插入位点侧翼序列

2．2．7 RNAi干涉载体构建

2．2．8 干涉转化子干涉后目的基因表达程度检测

3 结果与分析

3．1 指状青霉对抗生素的敏感性

3．1．1 指状青霉对潮霉素B抗性检测

3．1．2 指状青霉对卡那霉素、G418抗性检测

3．2 根瘤农杆菌介导指状青霉转化体系的优化

3．2．1 预培养中AS对转化效率的影响

3．2．2 指状青霉孢子浓度对转化效率的影响

3．2．3 共培养时间对转化效率的影响

3．2．4 共培养温度对转化效率的影响

3．2．5 不同承载膜对转化效率的影响

3．3 待定转化子PCR检测

3．4 转化子的遗传稳定性检测

3．5 转化子的致病力检测

3．6 Southern blot分析

3．7 Tail-PCR分析

3．8 干涉载体构建

3．9 干涉程度检测

4 讨论

4．1 根瘤农杆菌介导柑橘指状青霉转化体系的优化

4．1．1 预培养中AS对转化效率的影响

4．1．2 指状青霉孢子浓度对转化效率的影响

4．1．3 共培养温度和时间对转化效率的影响

4．1．4 不同承载膜对转化效率的影响

4．2 转化子的遗传稳定性及分子分析

4．2．1 转化子的遗传稳定性分析

4．2．2 转化子的阳性分析

4．2．3 转化子拷贝数分析

4．3 Tail-PCR扩增侧翼序列

4．4 RNAi验证基因功能

展望

参考文献

致谢