鸭坦布苏病毒激活NF-κB并诱导IFn-β的信号通路的分子机制研究

摘要

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是2010年以来新出现的一种黄病毒科黄病毒属病毒，给我国的养鸭业造成了严重的经济损失。DTMUV感染的病鸭临床表现出厌食、萎靡不振、腹泻和蛋鸭产蛋量下降等症状，目前对其致病的机理并不清楚。DTMUV可以被宿主的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs）识别，通过一系列的信号通路激活NF-κB并诱导产生IFN-β，进而诱导抗病毒的天然免疫反应。然而大量IFN-β的表达能诱导过量的炎症因子和趋化因子的表达，造成机体严重的病理损伤。本研究首次克隆了鸭TRAF6基因并分析了其在鸭天然免疫的作用，积累了一些研究鸭天然免疫反应的研究方法和技术手段，完善了本实验室鸭的天然免疫的研究平台。在此基础上，系统分析了DTMUV激活IFN-β的分子机制，为揭示DTMUV引起天然免疫反应和炎症损伤机制提供理论基础。具体内容如下:
　　1.鸭TRAF6的克隆与功能研究
　　本研究首次克隆了鸭TRAF6(duTRAF6)的全长eDNA(GenBankK J461514.1)。通过氨基酸序列比对及进化树分析发现duTRAF6与鸟类的进化关系最近。RT-PCR分析发现duTRAF6在鸭的脾脏、结肠、肌肉中表达丰度较高。通过荧光素酶报告系统检测的方法发现duTRAF6可以激活NF-κB且呈剂量依赖现象。通过构建一系列的duTRAF6突变体，发现zinc fingers结构域和coiled-coil结构域是duTRAF6激活NF-κB的关键结构域。siRNA干扰试验进一步证明duTRAF6在NF-κB信号通路中发挥着重要作用。该部分的研究为下面的研究积累了可靠的研究方法和关键的技术手段。
　　2.DTMUV感染DEFs通过RIG-Ⅰ、MDA5、TLR3和MAVS激活NF-κB、IRF1并诱导IFN-β的产生
　　通过RT-PCR方法发现DTMUV感染后IFN-α/β/γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、TNF-α的mRNA表达水平显著上调，提示DTMUV的感染可以激活DEFs的天然免疫反应。利用荧光素酶报告系统发现DTMUV感染显著地激活转录因子NF-κB、IRF1并诱导产生IFN-β，且呈时间和剂量依赖性。为了揭示DTMUV诱导IFN-β产生的分子机制，本研究通过超表达RIG-Ⅰ、MDA5的负调控突变体和转染TLR3、MAVS的siRNA分子分别对RIG-Ⅰ、MDA5和TLR3信号通路进行阻断，发现干扰这些通路后，DTMUV对IFN-β的激活显著降低，表明RIG-Ⅰ、MDA5和TLR3信号通路参与了DTMUV诱导IFN-β的产生。
　　3.DTMUV编码的NS5蛋白显著激活NF-κB、IRF1并诱导IFN-β的产生
　　为了进一步研究DTMUV编码的蛋白诱导IFN-β的作用，本研究通过荧光素酶报告系统对DTMUV编码的蛋白进行分析，发现DTMUV编码的NS5蛋白可以通过激活NF-κB、IRF1诱导IFN-β的产生，且呈现剂量依赖性。通过构建NS5蛋白的截短及点突变突变体，发现缺失了NLR(Nnuclear Localization Region)功能区和MTase(Methyltransferase)功能区的NS5(aa45-905)、NS5(aa224-905)截短突变体仍然能够显著地诱导IFN-β，而突变了RdRp活性位点的突变体NS5(D668A)和NS5(D536A)完全丧失了激活IFN-β的能力，提示NS5蛋白的RdRp活性与NS5诱导IFN-β的产生密切相关。
　　4.MDA5、MAVS、MyD88和TRIF参与NS5蛋白诱导IFN-β的产生
　　为了揭示NS5蛋白诱导IFN-β产生的信号通路，本研究在DF1细胞中通过siRNA对MDA5、MAVS、TRIF和MyD88进行基因沉默，发现干扰MDA5、MAVS、MyD88、TRIF后，NS5蛋白对IFN-β的激活显著降低，表明MDA5、MAVS、MyD88、TRIF参与了NS5蛋白诱导IFN-β的产生。
　　综上所述，本研究首次揭示了duTRAF6在鸭的天然免疫信号通路中发挥的重要作用;发现DTMUV通过RIG-Ⅰ、MDA5和TLR3相关的信号通路激活IFN-β;发现DTMUV编码的NS5蛋白能激活IFN-β，且依赖其RdRp活性，并分析了NS5激活IFN-β的信号通路。本研究为揭示DTMUV引起的天然免疫反应提供了一些技术方法和一定的理论基础。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 鸭坦布苏病毒(DTMUV)简介

1．1．1 DTMUV的流行病学

1．1．2 DTMUV的分子生物学特征

1．1．3 DTMUV NS5蛋白简介

1．2 天然免疫相关的信号通路简介

1．2．1 TLRs介导的抗病毒天然免疫

1．2．2 RLRs介导的抗病毒天然免疫

1．2．3 TRAF6及其相关信号通路简介

1．3 黄病毒属其它成员引起的天然免疫应答简介

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 菌株、毒株与细胞

3．1．2 质粒与载体

3．1．3 引物和干扰分子

3．1．4 工具酶及主要试剂

3．1．5 培养基和抗生素的配制

3．1．6 主要缓冲液和试剂及其配制

3．1．7 主要实验仪器及设备

3．1．8 分子生物学分析软件

3．2 实验方法

3．2．1 细胞、病毒样品的总RNA的提取和cDNA的合成

3．2．2 目的基因的PCR扩增

3．2．3 PCR产物或酶切产物回收与纯化

3．2．4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3．2．5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3．2．6 质粒的制备与鉴定

3．2．7 质粒转染(脂质体介导转染法)

3．2．8 双荧光素酶检测实验

3．2．9 实时荧光定量PCR

3．2．10 Western Blot样品准备

3．2．11 双荧光素酶检测试验

3．2．12 统计学分析

4 结果与分析

4．1 鸭TRAF6基因的克隆与功能的研究

4．1．1 TRAF6基因的克隆与序列比对分析

4．1．2 TRAF6蛋白的组织差异表达情况及亚细胞定位分析

4．1．3 duTRAF6的zinc fingers功能域和coiled-coil功能域对其激活NF-κB并诱导产生IFN-β发挥重要的作用

4．1．4 duTRAF6参与poly(I：C)或仙台病毒(SeV)诱导的NF-κB的激活

4．2 DTMUV感染DEFs显著激活NF-κB和IRF1，诱导IFN-β的产生

4．2．1 DTMUV感染DEFs对细胞因子的mRNA表达水平的影响

4．2．2 DTMUV感染DEFs对IRF1、NF-κB的激活及IFN-β的诱导呈时间和剂量依赖性

4．3 DTMUV感染DEFs通过RIG-I、MDA5、TLR3激活IRF1、NF-κB并诱导IFN-β的产生

4．4 DTMUV编码的NS5蛋白在DEFs和DF1中能够激活NF-κB和IRF1并诱导IFN-β的产生

4．4．1 DTMUV编码的NS5蛋白在DEFs和DF1中能够激活NF-κB和IRF1并诱导IFN-β的产生

4．4．2 NS5蛋白的RdRp活性与其激活IRF1、NF-κB并诱导IFN-β产生的作用相关

4．4．3 NS5及其各突变体蛋白的亚细胞定位

4．4．4 MDA5、MAVS、MyD88和TRIF参与NS5蛋白诱导IFN-β产生的作用相关

5 讨论

5．1 duTRAF6的克隆与激活NF-κB功能的研究

5．2 DTMUV激活NF-κB和IRF1，诱导IFN-β的产生的研究

5．3 DTMUV激活NF-κB、IRF1并诱导IFN-β产生的信号通路的研究

5．4 DTMUV编码的蛋白在激活NF-κB、IRF1并诱导IFN-β产生中的作用

6 结论

参考文献

研究生期间发表的论文

致谢