枯草芽胞杆菌168蛋白酶基因对纳豆激酶表达影响的研究

摘要

纳豆激酶(Nattkoinase，NK)是纳豆发酵过程中由纳豆芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶具有纤溶活性，可预防和治疗血栓疾病，它还可激活体内的纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量。通过枯草芽胞杆菌来表达纳豆激酶基因是获得纳豆激酶的重要途径之一。
　　枯草芽胞杆菌自身能分泌大量的胞内蛋白酶和胞外蛋白酶，这使得纯化枯草芽胞杆菌宿主所表达的异源蛋白酶变得困难，而且也使枯草芽胞杆菌表达的异源蛋白容易被宿主所分泌的蛋白酶降解。枯草芽胞杆菌自身所分泌的蛋白酶为将枯草芽胞杆菌开发为优良异源蛋白的表达系统宿主带来许多障碍。因此，研究枯草芽胞杆菌所分泌的蛋白酶对其表达异源蛋白体系的影响有重要意义。
　　目前已知枯草芽胞杆菌168（Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168）能分泌8种蛋白酶，它们的基因分别为：nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wprA。本研究选择了aprE、vpr、wprA这3种蛋白酶基因为靶标，重点研究了它们对枯草芽胞杆菌纳豆激酶表达体系的影响。
　　采用超表达的方法来研究枯草芽胞杆菌168中aprE、vpr和wprA这3种蛋白酶基因的超表达对该菌株表达重组纳豆激酶基因的影响。将这3个蛋白酶基因分别克隆到表达载体pBE43上，然后重组表达载体（pBE43-aprE、pBE43-vpr、pBE43-wprA）分别在枯草芽胞杆菌168中表达。提取含有这3种超表达蛋白的培养上清液，补加到枯草芽胞杆菌168表达重组纳豆激酶的发酵对数期细胞中。通过纤维蛋白平板检测纳豆激酶酶活方法来观察不同蛋白培养上清对纳豆激酶表达活性的影响。初步结果表明：aprE的超表达上清液对纳豆激酶表达有促进作用，vpr的超表达上清液抑制纳豆激酶的表达活性，wprA的超表达上清液对纳豆激酶表达有轻微抑制作用。
　　采用基因敲除的方法进一步验证了宿主枯草芽胞杆菌168中aprE、vpr和wprA这3种基因的单个缺失对枯草芽胞杆菌168表达重组纳豆激酶基因的影响。获得3种蛋白酶基因的单缺失宿主菌株△aprE、△vpr和△wprA，并将重组纳豆激酶表达载体pBE43-NA转入这3种单缺失菌株进行表达，结果发现缺失单个蛋白酶宿主菌所表达纳豆激酶活性比原始菌株所表达的纳豆激酶活性都要低，这说明宿主枯草芽胞杆菌168中aprE、vpr或wprA基因的缺失不利于纳豆激酶的表达活性提高。
　　综合以上两种方法的实验结果可知：在以枯草芽胞杆菌168作为宿主菌表达重组纳豆激酶基因时，该宿主菌蛋白酶基因aprE的表达对纳豆激酶的表达有明显促进作用，而vpr和wprA的影响不明显，还需进一步的验证。

目录

声明

1 前言

1.1 枯草芽胞杆菌及其研究进展

1.2 枯草芽胞杆菌蛋白酶及其研究进展

1.2.1 枯草杆菌蛋白酶基因aprE

1.2.2 蛋白酶基因vpr

1.2.3 蛋白酶基因wprA

1.3 纳豆激酶及其研究进展

1.3.1 纳豆、纳豆菌及纳豆激酶

1.3.2 纳豆激酶的生化特性

1.3.3 纳豆激酶的基因结构

1.3.4 纳豆激酶的蛋白质结构

1.3.5 纳豆激酶的作用药理

1.3.6 纳豆激酶的活性测定

1.4 研究目的、意义及主要内容

2 通过将蛋白酶基因进行超表达研究其对纳豆激酶表达的影响

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2 药品与试剂

2.1.3培养基与溶液

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1枯草芽胞杆菌基因组与质粒DNA、大肠杆菌质粒DNA的提取

2.2.2引物设计

2.2.3聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因

2.2.4 限制性内切酶反应

2.2.5 DNA琼脂糖电泳与电泳产物的回收纯化

2.2.6 连接反应

2.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备、质粒DNA转化及转化子鉴定

2.2.8 枯草芽胞杆菌感受态细胞制备、质粒DNA转化及转化子鉴定

2.2.9 DNA序列测定与序列比对

2.2.10 TCA沉淀法

2.2.11 聚丙烯酰氨凝胶电泳检测

2.2.12 表达载体的构建

2.2.13 纳豆激酶活性的检测

2.2.14 尿激酶标准曲线的制作

2.2.15 纳豆激酶在不同菌株中纤维活性的比较

2.3 结果与分析

2.3.1表达载体的验证

2.3.2 尿激酶标准曲线的制作

2.3.3 纳豆激酶酶活的检测

2.3.4 小结

2.4 讨论

3 通过对蛋白酶相关基因的敲除研究其对纳豆激酶表达的影响

3.1实验材料

3.1.1菌株与质粒

3.1.2 药品与试剂

3.1.3培养基与溶液

3.1.4主要仪器

3.2实验方法

3.2.1枯草芽胞杆菌基因组与质粒DNA、大肠杆菌质粒DNA的提取

3.2.2引物设计

3.2.3聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因

3.2.4 限制性内切酶反应

3.2.5 DNA琼脂糖电泳与电泳产物的回收纯化

3.2.6 连接反应

3.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备、质粒DNA的转化及转化子鉴定

3.2.8 枯草芽胞杆菌感受态细胞制备、质粒DNA转化及转化子鉴定

3.2.9 DNA序列测定与序列比对

3.2.10 敲除载体的构建

3.2.11 同源重组法敲除目的基因

3.2.12 基因敲除流程

3.2.13 纳豆激酶在枯草芽胞杆菌168及缺失菌株中表达的比较

3.3 结果与分析

3.3.1 基因敲除载体的构建

3.3.2 枯草芽胞杆菌蛋白酶相关基因缺失突变株的构建和鉴定

3.3.3 纳豆激酶在枯草芽胞杆菌168及缺失菌株中表达的比较

3.3.4 小结

3.4 讨论

参考文献

致谢