蛋用鹌鹑产蛋相关基因克隆、表达及其与性状的关联性研究

摘要

产蛋性状一直是家禽生产中非常重要的性状之一，对于家禽养殖效益具有决定意义。蛋用鹌鹑是家禽生产中的重要特禽，具有适应环境能力强、生长速度快、性成熟早、产蛋多、耗料少、生产周期短等优点，是近年来家禽产业中发展较快的一支，被誉为继养鸡之后的“第二家禽业”。目前已经通过传统的育种方法相继培育出多个可供生产应用的蛋用鹌鹑品种（配套系），并开展了一些鹌鹑分子生物学方面的研究工作。然而，相对于鸡和其它畜禽，针对鹌鹑的相关分子生物学标记的开发较少，研究明显滞后，极大限制了分子生物技术在蛋用鹌鹑育种中的应用。利用候选基因法并借鉴在猪、鸡等畜禽上已获得的成果、经验开展蛋用鹌鹑产蛋相关基因的研究，将对于深入了解鹌鹑产蛋性状的形成机理、开发可利用的分子生物学标记，最终推进我国蛋用鹌鹑分子育种进程具有积极的意义。
　　本研究以我国自主培育的鹌鹑配套系—神丹Ⅰ号鹌鹑的H系、L系及野外捕捉的野生鹌鹑群体作为研究对象，选择与鹌鹑产蛋性状相关的ESR1、GnRH1、PRLR、VIPR-1基因作为侯选基因，开展鹌鹑产蛋相关候选基因的克隆、表达、单核苷酸多态性检测及性状关联性分析研究。主要研究结果如下:
　　1.采用PCR-RFLP技术对鹌鹑ESR1基因的外显子1、外显子4和外显子8进行SNP筛查，共检测到5个新SNPs位点，其中C312T位点、C50T位点和C91T位点分别导致了限制性内切酶PvuⅡ、Hpy18I和AccⅠ酶切位点的改变。
　　采用PCR-RFLP方法分析了三个突变位点在不同鹌鹑群体中的基因型分布，结果发现:不同突变位点在不同鹌鹑群体间的基因型频率和等位基因频率分布均存在显著差异，无论是C312T、C50T或C91T位点，在H群体中，C等位基因均为其优势基因，而在野生鹌鹑群体中，等位基因T一直为优势基因;基因型、单倍型与鹌鹑繁殖性状的关联分析结果表明:外显子1的C312T位点对鹌鹑开产日龄具有显著影响;外显子4上C50T突变位点与鹌鹑开产日龄和20周产蛋量存在相关性。外显子8上C91T位点与鹌鹑的开产日龄、产蛋数、20周蛋重之间存在相关，且差异显著。单倍型分析结果表明，不同的单倍型个体H1H1(CTCT)或H1H3(CTTT)与鹌鹑20周蛋重、20周龄产蛋数之间存在相关性，且差异显著。
　　2.利用比较基因组学方法克隆出鹌鹑GnRH1基因部分cDNA序列359bp，生物信息学分析预测结果显示:该基因存在一个跨模结构域和一个信号肽（第1至第21氨基酸）区域;半定量RT-PCR分析结果表明，鹌鹑GnRH1基因在所检测的组织中存在表达差异。该基因在心脏、肺、腿肌、胸肌、胰脏中不表达，而在肠、肝脏、卵巢、脾脏、肾脏和下丘脑中有表达，其中以脾脏的表达量最高，下丘脑次之，肝脏的表达量最低。
　　在鹌鹑GnRH1基因的外显子2-3区域共检测到6个SNPs位点，其中C108T位于第2外显子区域，其突变为同义突变，其它5个突变位点位于内含子区域。
　　3.采用比较基因组及RACE方法克隆获得了鹌鹑PRLR基因编码区全长序列，该序列总长3106bp，包括CDS区、5'非翻译区和3'非翻译区;生物信息学预测分析发现，该基因具有一个跨模结构域和5处包含N末端糖基化位点(N-X-S或N-X-T);半定量RT-PCR分析结果显示，鹌鹑PRLR基因在所有检测组织中广泛表达，其中表达量最高的为肠、其次为下丘脑、心脏，胸肌、腿肌，卵巢中的表达量最低。在鹌鹑PRLR基因的内含子1区域检测到6个SNP位点，其中C104T突变位点能够被Hpy188I酶切，性状关联分析结果表明:该突变位点形成的三种基因型分别与鹌鹑的开产日龄和20周产蛋数存在相关性，且存在明显差异。
　　4.通过PCR-RFLP的方法，结合基因池策略，开展了VIPR-1基因外显子4-7区域，序列长度2021bp范围内基因的多态性扫描，从研究中共检测到突变位点36个，其中有3个突变位点位于外显子区域，其它突变均位于内含子区域。选择两个位点G373T和A313G进行酶切分型，发现两个位点在三个鹌鹑群体中的等位基因频率存在差异。在G373T位点，等位基因T为H群体的优势等位基因，基因频率为0.5417;而在A313G位点，等位基因G为三个群体中的优势基因，频率在0.6176-0.625之间;相关性分析表明，各基因型与鹌鹑繁殖性能之间存在相关，其中在H系和L系中，两种突变G373T和A313G形成的基因型均与鹌鹑的20周蛋重之间存在相关性;单倍型分析结果表明，不同的单倍型个体H1H1(GGGG)或H1H4(GGTA)与鹌鹑20周蛋重、20周龄产蛋数之间存在相关性，且差异显著。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 国内外鹌鹑产业的发展现状

1．1 世界鹌鹁产业的发展概况

1．2 我国鹌鹑产业的发展现状

2 分子标记及其在畜禽生产中的应用

2．1 分子标记的种类

2．2 SNP特点及其应用

3 分子标记在鹌鹁上的研究现状及存在问题

3．1 鹌鹑羽色基因的研究

3．2 鹌鹑生产性能候选基因及遗传多样性方面的研究

3．3 鹌鹑免疫蛋白抗体的研究

3．4 鹌鹑性别分化及其和鸡杂交试验的研究

3．5 鹌鹑遗传学分类研究

3．6 其他方面的研究

4 家禽繁殖相关候选基因的研究现状

4．1 催乳素基因及其受体基因

4．2 血管活性肠肽及其受体基因

4．3 雌激素及其受体(ESR)基因

4．4 促性腺激素释放激素基因

5 本研究的目的及意义

第二章 鹌鹑ESR1基因SNP检测及其与繁殖性状的关联

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果

3．1 鹌鹁ESR1基因部分外显子序列的SNPs检测

3．2 C312T位点在不同鹌鹑群体中的基因型分布

3．3 C312T位点与鹌鹁繁殖性状关联分析

3．4 C50T位点在不同鹌鹑群体中的基因型分布

3．5 C50T位点与鹌鹑繁殖性状关联分析

3．6 三个鹌鹑群体中C312T和C50T位点连锁不平衡分析

3．7 C312T和C50T位点在H型群体重构单倍型与繁殖性状关联分析

3．8 C312T和C50T位点在L型群体重构单倍型与繁殖性状关联分析

3．9 C91T位点在不同鹌鹑群体中的基因型分布

3．10 C91T位点与鹌鹁繁殖性状关联分析

4 讨论

4．1 选择造成了鹌鹑群体遗传结构的变化

4．2 鹌鹑ESR1基因具有多态性

4．3 鹌鹁ESR1基因变异影响鹌鹑的产蛋性能

5 结论

第三章 鹌鹑GnRH1基因的克隆及其功能研究

1 前言

2 试验材料与试验方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 鹌鹁肝脏组织总RNA的质量检测

3．2 鹌鹁GnRH1基因cDNA部分序列的克隆及生物信息学分析

3．3 鹌鹑GnRH1基因系统进化树的构建

3．4 鹌鹑GnRH1基因组织表达谱分析

3．5 鹌鹑GnRH1基因部分编码区SNPs的检测

4 讨论

4．1 关于生物信息学对基因功能分析的作用

4．2 鹌鹑具有和鸡等较近的亲缘关系

4．3 GnRH1基因在不同物种中的组织分布存在差异

5 结论

第四章 鹌鹑PRLR基因克隆及其功能研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 总RNA质量检测及5’、3'-UTR扩增

3．2 鹌鹑PRLR基因部分cDNA序列分析

3．3 鹌鹑PRLR基因系统进化树

3．4 鹌鹁PRLR基因组织表达谱

3．5 鹌鹑PRLR基因编码区SNPs检测

3．6 C104T位点在不同鹌鹑群体中的基因型分布

3．7 C104T位点与鹌鹑繁殖性状关联分析

4 讨论

4．1 关于基因克隆

4．2 PRLR基因在不同物种各组织中分布差异

4．3 PRLR基因多态性丰富且与产蛋量性状相关度较高

5 小结

第五章 鹌鹑VIPR-1的SNP检测及其与繁殖性状的关联

1 前言

2 试验材料与试验方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果

3．1 鹌鹑VIPR-1基因的SNP检测

3．2 G373T位点在不同鹌鹑品种的基因型分布

3．3 鹌鹁VIPR-1基因突变位点G373T与鹌鹑繁殖性状关联分析

3．4 鹌鹑VIPR-1基因突变位点A313G在不同鹌鹑群体中的基因型分布

3．5 鹌鹑VIPR-1基因突变位点A313G与鹌鹁繁殖性状关联分析

3．6 三个鹌鹑群体中G373T和A313G位点连锁不平衡分析

3．7 鹌鹁VIPR-1基因突变位点G373T和A313G在H型群体重构单倍型与繁殖性状关联分析

3．8 鹌鹑VIPR-1基因突变位点G373T和A313G在L型群体重构单倍型与繁殖性状关联分析

4 讨论

4．1 VIPR-1基因具有丰富的多态性

4．2 不同鹌鹑群体遗传结构分析

4．3 鹌鹑VIPR1基因变异会影响鹌鹑的产蛋性能

5 结论

第六章 结论与展望

1 已取得结果

2 本研究的创新点和特色

3 本研究的不足与值得进一步研究的问题

参考文献

致谢

在读期间发表(投稿)论文题录