植物sgRNA设计工具CRISPR-P改进升级

摘要

成簇规律间隔短回文序列（CRISPR）是一种存在于原核生物中的免疫相关序列，近年来生物学家将这种免疫机制进行了改造，开发出了一种可对真核细胞基因进行编辑的全新基因编辑技术。CRISPR基因编辑技术以其操作简便、高效、费用低廉和适于大规模运用等优点，在基因编辑领域引起了一场风暴，并有取代传统基因编辑技术的趋势。在使用CRISPR技术编辑细胞基因的实验中，提前设计高效率、低脱靶率的sgRNA是其中重要的一步。本实验室在2014年初开发了一款为植物CRISPR实验设计sgRNA的在线工具CRISPR-Pv1.0。近两年CRISPR技术发展迅速，为了能使CRISPR-Pv1.0这款工具能适应CRISPR技术的发展，本论文针对CRISPR-Pv1.0进行了相应的升级改进以及添加了一些实用的功能。主要改进如下：
　　（1）采用新的算法显著提升sgRNA的打靶效率，并能有效降低脱靶率；（2）CRISPR在这两年中的一个重要发展是发现了许多Cas9蛋白的同源蛋白、突变体以及区别于传统的CRISPR/Cas系统的新一代CRISPR系统。在CRISPR-Pv2.0中，我们添加了对这些新蛋白和新系统的支持；（3）sgRNA的二级结构能明显影响CRISPR系统的打靶效率，因此我们对每个找到的sgRNA的二级结构进行了预测；（4）对sgRNA进行微同源序列剪切模式的预测，以提高基因敲除的效率；（5）因为CRISPR-Pv2.0采用了新的打分算法，运行速度比之前慢，所以针对一些常用物种，我们建立了全基因组的sgRNA序列数据库，提高sgRNA设计的效率；（6）添加了sgRNA长度选择、设计带oligo的sgRNA、sgRNAScaffold自定义等功能，方便用户进行个性化的sgRNA设计。

目录

声明

缩略词表

1前言

1.1 CRISPR技术介绍

1.1.1 CRISPR系统发展历史

1.1.2 CRISPR系统的分子结构

1.1.3 CRISPR系统分类

1.1.4 CRISPR/Cas系统作用机制

1.1.5 CRISPR/Cas系统应用

1.2研究目的和意义

1.2.1植物sgRNA设计工具CRISPR-P v1.0

1.2.2 CRISPR-P v2.0改进介绍

2方法与结果

2.1引言

2.2方法概述

2.2.1 CRISPR/Cas特异性（脱靶效应）

2.2.2 CRISPR/Cas效率

2.2.3 CRISPR系统PAM序列选择

2.2.4 RNA二级结构预测

2.2.5微同源结构对基因编辑的影响

2.2.6使用工具

2.3功能实现

2.3.1 sgRNA特异性评估的实现

2.3.2 sgRNA剪切效率预测功能的实现

2.3.3独立的sgRNA设计模块

2.3.4自定义tracrRNA

2.3.5自定义spacer长度

2.3.6 DNAoligo设计

2.3.7 sgRNA提交

2.3.8增加多PAM序列支持

2.3.9 sgRNA二级结构预测

2.3.10微同源序列剪切模式预测

2.3.11 sgRNA数据库

2.3.12下载离线结果

2.3.13其它改进

2.4利用CRISPR-P v2.0设计sgRNA

2.4.1初步设计

2.4.2进一步筛选

3结论与展望

3.1结论

3.2展望

参考文献

致谢