α螺旋抗菌肽与α防御素4抗病原微生物活性及作用机制研究

摘要

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)作为广谱抗菌、抗病毒且不易引起耐药的小分子多肽药物受到广泛重视，在医学、农业、材料等领域开展了大量应用研究。现阶段我国养猪业面临着耐药菌株不断出现、病毒病流行等困扰，研究可抑制病原复制的新型制剂，具有重要现实意义。因此本研究选取α螺旋抗菌肽cecropin B，moricin，piscidin，caerin, maculatin和其它结构的lactoferricin B，indolicidin作为代表，研究其对猪场常见病原的抑制活性及作用机制。进而以HNP4作为代表性多肽，研究其结构与功能关系，为进一步解析其作用机理奠定基础。主要研究结果如下:
　　一、cecropin B和moricin对猪场常见病原菌的抗菌活性及作用机制研究
　　1、筛选具有抗菌效果的抗菌肽通过对副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌等八种猪场常见细菌的抗菌活性研究，发现moricin对所有病原菌均具有抑制作用，而cecropinB对革兰氏阴性菌有更强烈抑制作用。通过杀菌曲线发现二者能够在短时间内杀灭所有细菌。
　　2、细菌疏水性、电荷性与对cecropin B敏感性之间的关系测试了cecropin B对副猪嗜血杆菌标准菌株及部分临床菌株的抑制作用，发现均具有较好的活性(MIC为2μg/ml-16μg/ml)。通过十六烷吸附试验和电泳试验研究了不同菌株膜表面的疏水性和电荷性，与其对cecropinB的敏感性之间建立关系，发现疏水性越强和带负电荷越多的菌株对cecropinB越敏感。
　　3、抗菌肽cecropin B引起副猪嗜血杆菌形态学变化的观察利用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)等手段观察细菌形态变化。发现cecropinB能够损坏细菌膜导致质膜分离、内容物外泄和中空细胞等现象。同时可以观察到致密电子点形成等细菌内部结构改变。表明抗菌肽能作用于细菌膜结构，同时也有可能作用于细菌内靶位点。研究结果表明cecropinB可作为候选的抗革兰氏阴性菌药物开发。
　　二、抗菌肽对猪源病毒的抑制活性和作用机制研究
　　1、抗病毒多肽的筛选由于moricin和cecropinB对病毒抑制作用不明显，根据报道重新选取了五种不同来源的抗菌肽piscidin，maculatin，caerin，lactoferricin B，indolicidin对伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)进行抗病毒活性研究。TCID50测定piscidin，maculatin，caerin对大部分病毒抑制作用较强，抗病毒活性与其浓度呈正比。piscidin和caerin处理PRV后的病毒存活率仅为2％，作用最强，并可抑制不同伪狂犬病毒毒株。
　　2、抗菌肽对PRV复制过程的抑制研究通过病毒感染前多肽处理细胞、病毒感染后多肽处理细胞以及多肽直接处理病毒粒子三种方式，研究抗菌肽对病毒复制阶段的影响。发现maculatin，caerin和piscidin均直接作用于病毒粒子。通过非线性回归分析计算IC50，表明多肽对PRV的抑制活性从高到低为:piscidin＞ maculatin＞caerin。细胞凋亡检测发现抗菌肽能够显著抑制病毒引起的细胞凋亡。
　　3、用小鼠作为模型，测定piscidin抗PRV感染的能力通过小鼠试验，发现piscidin在低至2.5μg/ml浓度时仍能杀灭PRV，对小鼠提供90％的保护，并且在大于5μg/ml浓度时就能够完全保护小鼠免受PRV致死性感染。这表明piscidin可以作为抗病毒药物进行开发。
　　三、HNP4的结构-功能活性研究
　　1、氨基酸和结构改变对HNP4抑菌活性的影响首先合成、纯化出高质量HNP4及突变体，通过抑菌试验发现HNP4对E.coli的抑制活性强于对S.aureus的抑制作用。所有HNP4精氨酸突变体对E.coli和S.aureus的活性均比HNP4低很多。但是对HNP4影响最大的是位于26位的苯丙氨酸。其相对应的突变体F26A-HNP4对S.aureus的抑制作用几乎完全丧失，但对E.colli的抑制作用没有影响。二聚对HNP4抗革兰氏阴性菌活性影响不大，但其革兰氏阳性菌抑制活性下降约3倍。因此HNP4很有可能是采取两种不同的机制来抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
　　2、氨基酸和结构改变对HNP4抑制炭疽杆菌致死因子(LF)活性和结合gp120活性的影响通过非线性回归分析，发现同抑菌试验结果类似，26位的苯丙氨酸对HNP4的活性影响最大，精氨酸次之。HNP4的单体MeLeu20-HNP4对LF和gp120结合能力也明显下降。上述研究结果表明对HNP4功能影响最大的是26位苯丙氨酸，其次是精氨酸。二聚也会影响HNP4的部分功能。
　　总之，本研究发现了能抑制副猪嗜血杆菌和伪狂犬病毒的抗菌肽cecropinB和piscidin。同时通过HNP4结构-功能关系研究，发现了对HNP4功能活性影响最大的苯丙氨酸和精氨酸，获得了研究抗菌肽结构-功能关系的技术方法和思路。为进一步研制抗猪源病原微生物的新型制剂及临床应用打下基础。

目录

声明

摘要

缩略词(ABBREVIATION)

第1章 文献综述

1．1 抗菌肽研究进展

1．1．1 理化特征

1．1．2 结构分类

1．1．3 抗菌机制研究

1．1．4 抗病毒机制研究

1．1．5 外源表达与应用

1．2 α螺旋抗菌肽

1．2．1 非脊椎动物α螺旋抗菌肽

1．2．2 鱼类α螺旋抗菌肽

1．2．3 两栖动物α螺旋抗菌肽

1．2．4 哺乳动物α螺旋抗菌肽

1．3 防御素研究进展

1．3．1 分类与命名

1．3．2 鉴定历史

1．3．3 对细菌的抑制作用

1．3．4 对艾滋病病毒的抑制作用

1．3．5 对炭疽杆菌致死因子的抑制作用

1．3．6 结构-功能活性研究

第2章 α螺旋抗菌肽对猪源病原菌的抗茵活性及作用机制研究

2．1 研究目的与意义

2．2 材料与方法

2．2．1 菌株

2．2．2 抗菌肽与抗生素

2．2．3 主要生化试剂

2．2．4 培养基的配制

2．2．5 细菌培养

2．2．6 抑菌试验

2．2．7 细菌的疏水性试验

2．2．8 细菌的电泳试验

2．2．9 透射电子显微镜样品准备及观察

2．2．10 扫描电子显微镜样品准备及观察

2．2．11 原子力显微镜样品准备及观察

2．3 结果与分析

2．3．1 Ceropin B和moricin的结构特征

2．3．2 Cecropin B和moricin的抗菌活性

2．3．3 Cecropin B和moricin对副猪嗜血杆菌的杀菌曲线

2．3．4 Cecropin B和moricin的溶血活性

2．3．5 Cecropin B和moricin对不同浓度细菌的抗菌活性试验

2．3．6 透射电子显微镜下观察抗菌肽对副猪嗜血杆菌形态的影响

2．3．7 Cecropin B对标准血清型副猪嗜血杆菌及临床分离菌株的抗菌活性

2．3．8 副猪嗜血杆菌标准菌株的疏水性和电荷性

2．3．9 副猪嗜血杆菌的疏水性、电荷性与对cecropm B敏感性之间的关系

2．3．10 扫描电子显微镜下观察cecropin B对副猪嗜血杆菌形态的影响

2．3．11 原子力显微镜下观察cecropin B对副猪嗜血杆菌形态的影响

2．4 讨论

2．4．1 Cecropin B和moricin的结构与功能关系

2．4．2 Cecropin B和moricin的抗菌活性及安全性

2．4．3 透射电子显微镜结果揭示cecropin B和moricin的作用机制

2．4．4 Cecropin B对不同血清型副猪嗜血杆菌的抗菌活性

2．4．5 副猪嗜血杆菌疏水性、电荷性与对cecropin B敏感性之间的关系

2．4．6 扫描电子显微镜和原子力显微镜结果揭示的cecropin B作用机制

2．5 小结

第3章 α螺旋抗菌肽对猪源病毒的抗病毒活性及作用机制研究

3．1 研究目的与意义

3．2 材料与方法

3．2．1 毒株与细胞

3．2．2 抗菌肽与试剂

3．2．3 培养基与溶液的配制

3．2．4 实验动物

3．2．5 细胞活力测定

3．2．6 抗菌肽的抗病毒活性试验

3．2．7 抗菌肽的作用阶段试验

3．2．8 抗菌肽对细胞凋亡的影响

3．2．9 抗菌肽对伪狂犬病毒感染小鼠的保护性试验

3．3 结果与分析

3．3．1 抗菌肽对五种病毒的抑制作用分析

3．3．2 抗菌肽对细胞的安全浓度测定

3．3．3 抗菌肽对伪狂犬病毒不同毒株的抗病毒活性

3．3．4 抗菌肽直接作用于伪狂犬病毒

3．3．5 抗菌肽可抑制伪狂犬病毒引起的细胞凋亡

3．3．6 抗菌肽对小鼠的保护作用

3．4 讨论

3．4．1 抗菌肽的抗病毒活性

3．4．2 抗菌肽对不同毒株的作用

3．4．3 抗菌肽对伪狂犬病毒复制阶段的影响

3．4．4 抗菌肽对细胞凋亡的影响

3．4．5 抗菌肽对伪狂犬病毒感染小鼠的保护作用

3．5 小结

第4章 HNP4的结构功能关系研究

4．1 研究目的与意义

4．2 材料与方法

4．2．1 试剂与溶液

4．2．2 菌株与实验仪器

4．2．3 多肽合成

4．2．4 LF催化底物合成

4．2．5 氟化氢切割

4．2．6 多肽折叠

4．2．7 多肽纯化

4．2．8 多肽定量

4．2．9 LF酶活力抑制试验

4．2．10 虚拟菌落计数试验

4．2．11 表面等离子共振试验

4．3 结果与分析

4．3．1 HNP4突变体合成及鉴定

4．3．2 HNP4突变体对LF的结合强弱分析

4．3．3 HNP4突变体对LF酶活性的抑制作用

4．3．4 HNP4突变体对E．coli和S．aureus的抗菌活性

4．3．5 HNP4突变体对gp120的结合作用

4．3．6 MeLeu20-HNP4与HNP4之间的结合作用

4．3．7 二聚对HNP4抗菌活性的影响

4．3．8 二聚对HNP4抑制LF活性的影响

4．3．9 二聚对HNP4结合gp120活性的影响

4．4 讨论

4．4．1 阳离子氨基酸对HNP4功能活性的影响

4．4．2 疏水性氨基酸对HNP4功能活性的影响

4．4．3 二聚对HNP4功能活性的影响

4．5 小结

第5章 全文总结及展望

参考文献

个人资料

教育背景

在读期间发表论文

待发表论文

获奖与荣誉

学术交流

致谢