CYPPDK在水稻种子萌发中对温度的响应及磷酸化调节研究

摘要

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)具有催化形成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的功能，叶绿体型PPDK(chPPDK)是C4植物光合途径中生成CO2固定前体物质PEP的关键酶。在C4植物非光合组织和C3植物中还存在胞质型PPDK(cyPPDK)，已有少量研究表明其主要功能是参与糖代谢调节，并有调节非生物逆境适应性功能。本实验室前期研究表明水稻中主要存在cyPPDK，在籽粒灌浆期通过磷酸化水平修饰其活性参与胚乳淀粉积累过程，并在高温下对垩白形成具有调节作用。本研究试图探讨在水稻种子萌发和苗期是否存在PPDK的表达及其对温度的反应。
　　试验选用两个温度敏感性不同的水稻品种（9311和特籼占-25），在水稻种子萌发到出苗期进行34℃、24℃、18℃温度处理，测定处理后不同时间的cyPPDK的基因表达、酶蛋白含量及磷酸化修饰水平的变化，主要研究结果如下:
　　1.在种子萌发过程中，cyPPDK基因在种子吸水后48h开始大量表达，并在72h时达到最大，高温促进、低温抑制cyPPDK基因表达。种子萌发过程中均可检测PPDK蛋白的存在，其含量与基因表达水平不同步，存在温度处理间的差异。PPDK在磷酸化水平与基因表达水平表现一致，高温处理使磷酸化水平升高。上面各指标均存在品种间的差异，9311高于特籼占-25。
　　2.在三叶期水稻叶片中存在chPPDK基因表达，高温处理对9311中chPPDK表达影响不明显，而使特籼占-25中的chPPDK表达量下降，低温导致两个品种中chPPDK表达量均下降;cyPPDK蛋白量对温度的响应与chPPDK基因基本一致，磷酸化PPDK在高温处理时表达量较高。
　　3.两个品种均表现出高温加快种子萌发的进程，不同温度处理下可溶性糖含量逐渐升高，而淀粉含量逐渐下降，高温促进淀粉降解，提高可溶性糖含量，其中在9311在种子萌发进程、淀粉降解、可溶性糖增加方面均高于特籼占-25。
　　本研究中34℃高温处理没有对水稻种子萌发和幼苗生长产生不利影响，而18℃低温处理产生了明显的抑制作用。结果初步证实cyPPDK及其磷酸化调节在水稻种子萌发期就参与了水稻发育过程，并受到温度影响。水稻苗期叶片中可检测到chPPDK，其生理功能有待研究

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 PPDK国内外研究进展

1．1．1 C4植物中的PPDK

1．1．2 C3植物中PPDK及基因结构特征

1．1．3 PPDK在C4和C3植物中的比较

1．1．4 环境因子对PPDK的表达与活性的影响

1．2 种子萌发的生理基础

1．2．1 种子萌发过程的基因表达及翻译

1．2．2 种子萌发的生理生化改变

1．2．3 环境因素对种子萌发的影响

1．3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 研究内容及技术路线

2．1．1 研究内容

2．1．2 本研究的技术路线

2．2 材料

2．3 材料种植及温度处理

2．4 实验材料的取样

2．5 荧光定量PCR分析

2．5．1 总RNA的提取

2．5．2 DNase Ⅰ处理与RNA质量检测

2．5．3 反转录及PCR检测

2．5．4 荧光定量PCR测定

2．6 可溶性蛋白提取及含量测定

2．7 SDS-PAGE分析

2．8 Western Blot分析

2．9 可溶性糖、淀粉含量测定

2．10 数据分析

3 结果与分析

3．1 种子萌发过程中cyPPDK基因表达分析

3．1．1 RNA质量及反转录检测

3．1．2 萌发种子各时期不同处理不同品种cyPPDK基因表达分析

3．1．3 三叶期叶片中不同处理不同品种ch PPDK基因表达分析

3．2 种子萌发过程中PPDK蛋白的Western Blot分析

3．3 三叶期叶片中不同处理不同品种PPDK蛋白表达分析

3．4 萌发过程中磷酸化PPDK的Western Blot分析

3．5 三叶期叶片中不同处理不同品种磷酸化PPDK表达分析

3．6 种子萌发过程中可溶性糖、淀粉含量分析

3．7 温度对种子萌发速率差异的分析

4 讨论

4．1 温度对种子萌发过程中cyPPDK基因及蛋白表达的影响

4．2 温度对三叶期叶片中chPPDK基因及蛋白表达的影响

4．3 cyPPDK参与了水稻种子萌发以及苗期对温度的反应过程

5 主要结论

论文发表

参考文献

附录

致谢