‘黔阳无核’椪柑及胞质杂种‘华柚2号’雄性不育相关miRNA挖掘与分析

摘要

雄性不育是导致柑橘无核的主要原因，无核育种是柑橘品质改良的重要内容，研究柑橘雄性不育及无核分子机理可以为柑橘无核育种提供理论基础。microRNAs在植物生长发育过程中起着非常重要的调控作用。‘黔阳无核’椪柑是普通椪柑的无核芽变，具有雄性不育特征;‘华柚2号’是HB柚经原生质体融合转移了‘国庆一号’温州蜜柑线粒体基因组的雄性不育胞质杂种。本研究选用了这两个无核柑橘材料，分别以‘鄂柑一号’椪柑和HB柚为对照，利用高通量测序技术，发掘和鉴定出一系列可能与柑橘雄性不育性状相关的候选miRNAs，并利用降解组测序在全基因组范围内鉴定miRNAs的靶基因。此外，利用小RNA测序数据和在全基因组范围内鉴定出HB柚大量PHAS位点及phasiRNAs;利用柚降解组测序数据鉴定出一系列phasiRNAs的靶基因，构建了参与柑橘花发育的miRNAs/phasiRNAs-PHAS-phasiRNAs-target调控网络，以揭示miRNAs在柑橘花发育过程中的生物功能及其与柑橘雄性不育的关系。主要研究结果如下:
　　1.小RNA测序及降解组测序鉴定椪柑及柚miRNAs及其靶基因
　　选择椪柑花药发育减数分裂四分体时期的花器官及成熟的花药两个时期，以HB柚及‘华柚2号’雄蕊原基开始发育至小孢子释放过程中花器官的三个时期，对其进行小RNA测序及降解组测序，在椪柑中共鉴定出属于32个miRNA家族的156个known miRNAs和24个novel miRNAs，及138个靶基因;柚中鉴定出184个known miRNAs和22个novel miRNAs及86个靶基因。椪柑和柚miRNAs的大部分靶基因是转录因子，包括ARF转录因子、AP2转录因子、SBP-box转录因子、MYB转录因子等。利用5'RACE技术，椪柑和柚中分别有5个和8个靶基因验证出其相应的剪切位点，与降解组分析结果一致。
　　2.挖掘与柑橘雄性不育相关候选miRNAs
　　由小RNA测序丰度结果得到71个known miRNAs及11个novel miRNAs在两个椪柑材料中差异表达，42个known miRNAs在柚两个材料中差异表达;利用qRT-PCR及Northern杂交技术对miRNAs在花发育不同时期表达模式进行验证，包括miR156、miR167、miR399、miR397、miR172、miR827等，大部分miRNAs表达结果与测序数据一致，靶基因定量结果表明大部分靶基因受到了其对应的miRNAs的负调控，它们可以作为参与柑橘雄性不育的候选miRNAs。在这些差异表达的miRNAs中，miR167和miR399在两对材料中都显示出显著的表达差异;尤其在HB柚与‘华柚2号’胞质杂种中，这两个miRNAs家族中的几乎每一个成员都显示出明显的下调表达，表明miR167和miR399可能在雄性器官发育中起重要作用。
　　3.候选miRNAs功能分析与验证
　　酵母单杂交与双荧光素酶实验表明一个DREB转录因子可以与miR167a启动子互作并抑制其转录活性。构建了miR167a的超量表达载体分别转化了拟南芥和山金柑，拟南芥转基因植株花发育表现出明显的不育性状，花发育异常，花瓣闭合不开放，角果极短且无籽;构建了miR156a超量表达载体和miR399a靶基因mimic超量表达载体转化山金柑，目前miR156a转化山金柑获得一棵阳性植株，目前已开花结果，由于阳性植株较少还不能确定表型;miR399a靶基因mimic超量表达载体转基因山金柑获得27棵抗性苗，有17棵鉴定为阳性植株，花器官表型有待后期观察。
　　4.HB柚与胞质杂种中phasiRNAs鉴定
　　利用小RNA测序数据鉴定到280个PHAS位点，其中有157个来自基因间区域，143个PHAS位点属于编码基因;这些编码基因中有90个为抗病基因NB-LRR，12个为PPR基因，19个为长链非编码RNA，还有3个为转录因子，分别是NAC转录因子、ARF转录因子和MYB转录因子。有22个PHAS位点寻找到触发其产生phasiRNAs的12个miRNAs，包括miR167、miR390、miR3954、miR396、miR472、miR482、miR172等，有24个PHAS位点被19个phasiRNAs触发产生phasiRNAs，所有的PHAS位点共产生了2476个phasiRNAs;利用降解组数据总共鉴定到这些phasiRNAs的95个靶基因，这些靶基因参与了细胞碳水化合物代谢、芳香物质及脂质代谢、逆境响应及物质转运等过程。一个miR390-TAS-phasiRN As-ARF调控网络和一个由miR472和其他phasiRNAs直接或间接触发PPR位点产生phasiRNAs的调控网络被构建出来。以上结果表明MiRNA/phasiRNAs-PHAS-phasiRNAs-mRNA靶基因的调控网络可能参与柑橘雄性不育过程。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1 课题的提出

2 柑橘无核研究进展

2．1 柑橘无核发生原因

2．2 无核柑橘选育

3 雄性不育机理

3．1 花药发育过程

3．2 核雄性不育基因研究进展

3．3 核质互作雄性不育分子机理

4 植物小分子RNAs

4．1 小RNA分类

4．2 植物miRNAs研究进展

4．3 植物PhasiRNA的研究进展

5 植物miRNA与雄性不育

6 本研究的目的和内容

第二章 小RNA及降解组测序鉴定椪柑与柚花发育过程中的miRNA及其靶基因

1 引言

2 材料方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 椪柑及柚小RNA文库测序数据的整体分析

3．2 椪柑及柚known miRNAs和novel miRNAs鉴定

3．3 椪柑及柚miRNAs表达特征

3．4 利用降解组测序鉴定椪柑及柚miRNAs的靶基因

4 讨论

第三章 柑橘雄性不育相关miRNAs挖掘鉴定与功能分析

1 引言

2 材料方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 椪柑与柚中miRNAs及其靶基因差异表达验证

3．2 差异表达miRNAs靶基因GO富集分析

3．3 HB柚与‘华柚2号’花器官中激素测定

3．4 寻找miR167a上游调控因子

3．5 miR167a．1超量表达转化拟南芥

3．6 山金柑转基因验证几个miRNAs功能

4 讨论

4．1 miRNAs-靶基因的调控网络可能参与柑橘雄性不育发生过程

4．2 参与柑橘雄性不育发生过程的候选miRNAs

第四章 HB柚与‘华柚2号’phasiRNAs挖掘及功能分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 HB柚与‘华柚2号’花发育时期中PHAS位点及phasiRNAs挖掘

3．2 PHAS位点染色体定位

3．3 HB柚及胞质杂种中phasiRNAs表达分析

3．4 PHAS基因注释

3．5 寻找触发PHAS位点产生的miRNA

3．6 miRNA触发产生的phasiRNAs信息

3．7 寻找能触发PHAS位点产生phasiRNA的phasiRNAs

3．8 PhasiRNA的靶基因鉴定

3．9 miRNAs／phasiRNAs-PHAS-phasiRNA-靶基因的调控网络

4 讨论

第五章 结论与展望

参考文献

附录

附录Ⅲ 作者简介及博士学习期间发表论文

致谢