华癸根瘤菌7653R RNA伴侣蛋白Hfq共生固氮功能和生物学特性研究

摘要

Hfq(Host factor)是原核生物中广泛存在且高度保守的RNA伴侣蛋白，结构与真核生物Sm蛋白类似，通过参与ncRNAs(non-coding RNAs)与其靶标mRNAs的互作过程，在转录水平上进行调控。本文围绕华癸中慢生根瘤菌7653Rhfq基因的共生固氮功能及生物学特性展开研究，并在7653R中初步探索构建基因快速敲除的技术方法平台。
　　本研究通过构建单交换突变载体、两亲本接合转移和选择培养基筛选，获得了hfq插入失活突变株7653RΔhfq。对突变株的培养特征和共生表型进行了检测，结果显示在自生条件下突变株7653RΔhfq的生长速率比野生型减慢;共生条件下与突变株7653RΔhfq共生的紫云英表现出明显的缺氮特征，所形成的根瘤为白色小瘤，根瘤固氮酶活明显下降;采用荧光定量PCR检测了hfq基因的表达水平和特性，发现其在根瘤形成的各个阶段表达量基本持平，但自生状态下的表达量比共生条件高。基于高通量sRNA测序结果与分析，选择可能与Hfq互作的4个候选sRNA，比较检测了这4个sRNA在hfq突变株中的表达量变化。结果显示，Hfq很可能通过与这些sRNA互作影响共生固氮功能。对培养条件下的7653R和突变株7653RΔhfq进行了抗胁迫能力的比较，结果表明在应对热激处理、4.5％乙醇以及50mmol H2O2胁迫中，hfq都发挥了重要作用。
　　本研究还在7653R菌株中进行了基因快速敲除方法的探索，旨在将Red重组系统应用到根瘤菌中构建目标基因突变体。Red重组系统以其同源臂短，操作简便，重组率高的特点在大肠杆菌中得到了广泛运用，能够实现基因连续的缺失突变。本研究对Red重组系统进行了改造和初步的探索实验，为以后该技术方法的建立和应用提供了工作基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 生物固氮

1．2 豆科植物-根瘤菌的共生固氮

1．3 nfq蛋白

1．3．1 Hfq蛋白的结构特征

1．3．2 Hfq与RNA互作模式

1．3．3 Hfq的分子调控机制

1．3．4 Hfq蛋白功能的研究

1．3．5 根瘤菌中Hfq的研究现状

1．4 基因敲除方法建立

1．4．1 原核生物基因敲除

1．4．2 Red同源重组相关质粒

1．4．3 Red重组的应用

1．5 研究目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株和质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 酶、试剂和试剂盒

2．1．4 常用缓冲液与试剂

2．1．5 引物序列

2．1．6 抗生素

2．2 实验方法

2．2．1 分子生物学基本操作

2．2．2 7653R电转化感受态制备

2．2．3 重叠延伸PCR

2．2．4 两亲本接合转移

2．2．5 利用pK19mob构建单交换突变株

2．2．6 紫云英植物盆栽

2．2．7 固氮酶活测定

2．2．8 根瘤菌总RNA抽提

2．2．9 RT-PCR

2．2．10 荧光定量PCR分析

3 结果和分析

3．1 Hfq蛋白同源性分析

3．2 华癸根瘤菌Hfq插入失活突变株的构建

3．2．1 PCR扩增Hfq同源基因

3．2．2 置换载体构建

3．2．3 突变株的筛选

3．3 互补菌株构建

3．4 7653RΔhfq的共生表型鉴定

3．4．1 植物盆栽实验

3．4．2 石蜡切片和显微观察

3．5 Hfq基因的表达特征

3．6 7653RΔhfq生长曲线测定

3．7 7653RΔhfq抗胁迫能力测定

3．7．1 Hfq基因突变对热应激的影响

3．7．2 Hfq基因突变对乙醇和H2O2耐受性实验

3．8 Hfq突变对部分sRNA表达量的影响

3．9 基因突变新方法的初步构建

3．9．1 Red重组系统的引入

3．9．2 质粒pKD46的改造

3．9．3 抗性基因的扩增

3．9．4 不同大小同源臂扩增

3．9．5 同源重组事件发生

4 讨论

4．1 华癸中慢生根瘤菌7653R hfq基因的共生功能分析

4．2 关于Hfq影响7653R对外界胁迫环境应答的思考

4．3 关于Hfq突变影响7653R中部分RNA表达量的思考

4．3 新型基因敲除平台初步构建

4．4 未来工作思考

参考文献

致谢

发表文章情况