玉米ZmRB-GRPs全基因组鉴定、表达分析和耐冷功能研究

摘要

玉米是全球重要的粮食、能源、饲料和工业原料作物，低温已成为限制玉米产量提高的重要环境因子之一。因此，深入开展玉米耐冷机制的研究，培育玉米耐冷新品种，是我国乃至全世界玉米遗传改良的重要目标之一。RB-GRP（RNA-bindingglycine-rich protein）是富含甘氨酸的一类超级蛋白家族，在植物中广泛存在，与低温、盐离子、重金属、UV及激素响应相关。本研究利用生物信息学的方法鉴定了玉米ZmRB-GRP基因家族，并对部分基因的表达及耐冷功能进行了分析，主要结果如下:
　　1.玉米ZmRB-GRP全基因组检索分析表明玉米中存在23个ZmRB-GRP基因，分布在10条染色体上，其中15个靶向细胞核;进化分析表明ZmRB-GRP家族在玉米中分为4个亚组，有5对旁系同源基因，表明玉米ZmRB-GRP基因数目的增加方式主要为片段基因加倍;玉米、水稻、拟南芥和小麦的RB-GRP比较分析发现2个玉米特有的亚群，表明这些基因是在玉米进化后出现的或者在其它物种中还没有找到对应的基因;启动子及磷酸化预测分析表明ZmRB-GRP包含与多种非生物因子和生物因子响应相关的顺式作用元件。
　　2.从23个ZmRB-GRP基因中挑选8个（每个亚组选取2个），qRT-PCR分析表明这8个基因对盐离子、低温、温度恢复和ABA处理有响应;此外候选基因关联分析表明ZmRB-G RP、ZmRB-GRP5、ZmRB-GRP7和ZmRB-G RP14均与冷害条件下四个苗期耐冷性状（可溶性糖含量、含水量、叶片卷曲度和根茎比）中至少1个性状显著相关，表明这4个基因与玉米的苗期耐冷性相关。
　　3.ZmRB-GRP4、ZmRB-GRP5、ZmRB-GRP7和ZmRB-GRP14可冷互补 E.coli BX04突变体（低温敏感性菌株），表明它们在一定程度上可增强E.coli BX04对低温的耐受性。
　　4.核酸结合分析表明ZmRB-GRP4、ZmRB-GRP7和ZmRB-GRP14能与ssDNA结合，且结合能力与蛋白浓度及盐离子浓度相关，表明ZmRB-GRP4、ZmRB-GRP7和ZmRB-GRP14可能具有分子伴侣的功能。
　　5.35 S∷ZmRB-GRP4、35S∷ZmRB-GRP5和35S∷ZmRB-GRP14转化拟南芥T-DNA插入突变体atgrp7和atgrp2，结果表明这3个基因均可增强拟南芥突变体的耐冷性。
　　6.酵母双杂交显示ZmRB-GRP4、ZmRB-GRP5均与玉米DnaJ基因互作，表明二者均可能通过发挥分子伴侣的功能形成蛋白复合体来调节植株对低温的响应;而ZmRB-GRP4还与DEAD-Box RNA解旋酶(以下简称RH)互作，表明ZmRB-GRP4可能与RH形成复合体参与rRNA的生物合成过程来增强植物耐冷性。
　　总之，本研究利用生物信息及分子生物学实验对玉米ZmRB-GRP家族进行全基因组鉴定和分析，发现ZmRB-GRP4、ZmRB-GRP5、ZmRB-GRP7和ZmRB-GRP14在植物低温响应过程中起着重要作用，研究结果可为ZmRB-GRP的功能研究以及在玉米遗传改良上的应用奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．1．1 低温对植物的影响

1．1．2 玉米耐冷性鉴定方法和指标

1．1．3 玉米抗冷遗传研究进展

1．1．4 连锁分析和关联分析

1．2 RBP的分子伴侣功能

1．2．1 RB-GRP

1．2．2 RB-GRP的研究进展

1．2．3 DEAD-Box RNA解旋酶与RB-GRP的关系

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 ZmRB-GRP全基因组鉴定、基因结构、结构域和保守序列的分析

2．2．2 ZmRB-GRP的染色体分布、基因加倍和进化分析

2．2．3 ZmRB-GRP的磷酸化和顺势作用原件的分析

2．2．4 玉米基因组ZmRB-GRP的表达分析

2．2．5 ZmRB-GRP候选基因的关联分析

2．2．6 实时定量PCR(qRT-PCR)检测ZmRB-GRP在逆境下的表达分析

2．2．7 ZmRB-GRP在大肠杆菌中的低温响应

2．2．8 重组蛋白的表达、纯化和核酸结合活性分析

2．2．9 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定和ZmRB-GRP转基因耐冷分析

2．2．10 酵母双杂分析ZmRB-GRP与RH／DnaJ的互作关系

3 结果与分析

3．1 ZmRB-GRP全基因组鉴定、基因结构和结构域的分析

3．2 染色体分布和基因加倍分析

3．3 RB-GRP在玉米、拟南芥、水稻和小麦中的进化分析

3．4 ZmRB-GRP的磷酸化分析

3．5 ZmRB-GRP的顺式作用元件分析

3．5 ZmRB-GRP在玉米不同组织的表达

3．6 ZmRB-GRP在逆境下的表达分析

3．7 ZmRB-GRP候选基因耐冷关联分析

3．8 ZmRB-GRP在大肠杆菌中的低温响应

3．9 蛋白的表达和纯化及核酸结合活性分析

3．10 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定和转基因耐冷分析

3．11 ZmRB-GRP4／5与DnaJ、RH的互作分析

4 讨论

4．1 玉米中的RB-GRP

4．2 ZmRB-GRP与耐冷的关系

4．3 ZmRB-CRP耐冷的可能机制

参考文献

附录

附表

在读期间发表的文章

致谢