南方根结线虫效应蛋白Misp12功能分析和淡紫紫孢菌寄生适应性的比较基因组研究

摘要

根结线虫是一类重要的植物寄生线虫，能寄生植物根部形成根结，造成作物减产。线虫致病机理和生防菌杀虫机制是植物线虫学研究的两个重要领域。对根结线虫致病相关机理，如寄生相关基因特别是分泌效应蛋白等的研究，可以更好的了解根结线虫寄生过程中相关基因的调控，筛选出新的靶标基因为开发新型防治线虫药剂提供参考依据。同时，对线虫生防菌的寄生机理研究，有助于通过遗传改造提高生防菌的效果。
　　本论文通过生物信息学方法挖掘了南方根结线虫(Meloidogyne incognita)效应蛋白Misp12并对其功能进行了验证;通过基因组和转录组测序解析了线虫卵寄生真菌淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)卵寄生过程中的相关基因表达和对多种环境适应性的组学基础。
　　根结线虫在寄生取食植物根部时，分泌蛋白起着关键性的作用。现阶段的线虫效应蛋白研究集中在早期寄生过程中，少有对后期寄生过程中的效应蛋白的研究。本文通过生物信息学预测得到南方根结线虫效应子Misp12，然后进行克隆测序和表达动态分析，采用细胞定位和VIGS等试验对其进行了功能验证，研究发现Misp12基因基因长度为1202 bp，编码149个氨基酸长度的蛋白质，该基因在南方根结线虫中高度保守，基因少有突变;编码的蛋白由线虫的背腹食道腺特异表达，且在线虫成熟期即雌虫时期有相当高的表达量;亚细胞定位表明ΔspMisp12-GFP融合蛋白定位在植物细胞质中;VIGS沉默Misp12基因后根结数量、线虫数量和产卵量都有减少，尤其是雌虫数目减少最多;沉默后对相关信号途径的防御基因进行qRT-PCR，发现相对于对照组，沉默Misp12基因烟草植株防御基因都上调表达，而在烟草叶片上瞬时表达该基因能够抑制由INF1引起的细胞程序性死亡，该过程中植物细胞的SA信号途径基因会被抑制表达，说明该基因可能抑制了植物防御基因的表达。
　　作为一种能够寄生线虫卵的真菌，淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)有很高的生防价值。现在已有淡紫紫孢菌的生防制剂注册面市，但是该菌寄生线虫卵的机制仍不明确。本文通过对Illumina测序的淡紫紫孢菌的基因组和寄生线虫卵早期的转录组的比较分析发现淡紫紫孢菌与昆虫病原真菌亲缘关系近，尤其与冬虫夏草的亲缘关系最近，在74～94百万年前出现物种分离;与来自印度的测序菌株全基因组比对分析表明36-1的基因组具有更多的序列重排及SNP;淡紫紫孢菌重复序列诱导点突变(RIP)机制较弱，在进化过程中经受的选择压力较低;相对于其他真菌，淡紫紫孢菌富含丝氨酸蛋白酶、几丁质降解酶类、膜转运蛋白及信号转导基因;对附着胞形成相关基因表达分析，发现有357个基因被鉴定为附着胞相关基因，并且在侵染过程中起作用，其中有27个基因具有4倍以上的表达量;转录组分析表明淡紫紫孢菌寄生线虫的模式可能与绿僵菌属真菌侵染昆虫相一致，在侵染过程中可能会受到线虫胚胎的氧化防御反应; GO富集分析发现上调的基因主要集中在氧化还原活性，核糖体结构成分，转移酶活性以及膜转运蛋白活性上，KEGG富集分析发现上调表达基因主要集中在能量、氨基酸等代谢途径，表明淡紫紫孢菌在侵染线虫卵早期过程中经历了能量代谢的转换。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 根结线虫研究进展

1．1 根结线虫的危害和症状

1．2 根结线虫的生物学特性

1．3 根结线虫基因组

2 效应蛋白研究

2．1 细菌效应蛋白

2．2 真菌效应蛋白

2．3 线虫效应蛋白

3 VIGS在基因功能研究中的应用

3．1 VIGS的原理

3．2 VIGS的研究及应用进展

4 线虫生防资源

4．1 食线虫细菌

4．2 食线虫真菌

5 卵寄生真菌淡紫紫孢菌

5．1 淡紫紫孢菌分类地位及生物学特性

5．2 淡紫紫孢菌的生防机制

5．3 淡紫紫孢菌的生防制剂研究

6 基因组学研究进展

6．1 基因组测序技术发展

6．2 真菌基因组测序

6．3 真菌对比基因组学

6．4 真菌功能基因组学

7 转录组研究进展

8 研究的目的与意义

第二章 南方根结线虫效应蛋白Misp12的功能分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 生物信息学挖掘候选效应蛋白

2．2 Misp12基因序列扩增以及结构分析

2．3 Misp12基因对比及系统发育树分析

2．4 Misp12基因表达动态

2．5 Misp12基因线虫体内表达定位

2．6 Misp12蛋白植物中亚细胞定位

2．7 VIGS沉默效果检测

2．8 VIGS沉默后根结和线虫数量变化

2．9 VIGS沉默后植物防御基因表达量

2．10 Misp12能抑制细胞程序性死亡

2．11 VIGS沉默后巨型细胞变化

2．12 IAA诱导Misp12基因表达

3 讨论

第三章 淡紫紫孢菌36-1菌株寄生适应性的比较基因组研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 基因组组装质量的评估

2．2 基因组特征概述

2．3 共线性分析

2．4 基因组进化分析

2．5 系统发育分析

2．6 细胞壁降解相关基因的鉴定与比较

2．7 丝氨酸和金属蛋白酶分析及其在寄生过程中的作用

2．8 几丁质代谢相关基因分析

2．9 膜转运蛋白鉴定与分析

2．10 信号转导基因在侵染中的作用

2．11 效应蛋(effector)的鉴定

2．12 次生代谢产物合成基因的鉴定

2．13 附着胞形成相关基因的表达

2．14 侵染过程中明显的代谢转换过程

3 讨论

第四章 研究总结与展望

参考文献

博士期间发表成果

致谢

附录