水稻光敏感雄性核不育基因pms1的克隆与功能分析

摘要

水稻是全球一半以上人口的主粮，如何提高水稻产量一直是各国科学家致力于解决的关乎国计民生的重大课题。50年前袁隆平先生提出了杂交稻的构想，并随后将之应用于生产实践中，为我国粮食安全做出了巨大的贡献。中国杂交稻的生产经历了从三系稻到两系稻的发展，两系稻占我国杂交稻种植面积的比例越来越高。相对于三系不育系，两系不育系恢复系广、配组更为自由，大大简化了杂交过程，应用潜力巨大。两系不育系是指光温敏雄性不育系，其育性受到温度和光照长度的影响:光敏不育系在长日照下不育、短日照下可育;温敏不育系在高温下不育、低温下可育。粳稻品种农垦58S是第一个被发现也是研究和应用最广泛的光敏雄性不育系，以农垦58S为基因源培育出了大批优良的光温敏雄性不育系。为了更好地利用两系不育系，有必要分离控制光温敏雄性不育性的基因并阐明其分子作用机理。pms1是农垦58S中控制光敏雄性核不育的主效基因，我们构建了农垦58S与明恢63的高世代回交群体以图位克隆pms1基因并对其进行功能分析，得到的主要研究结果如下:
　　1.与以往的认识不同，通过对农垦58S与明恢63回交F2群体的结实率和基因型分析表明，光敏感雄性核不育基因pms1是一个不完全显性基因。在长日照下BC5F2群体中纯合的农垦58S pms1位点表现为完全不育;纯合的明恢63 pms1位点表现为完全可育;而杂合基因型的育性呈现出从不育到可育连续分布的趋势，并且绝大部分植株育性低于60％。明恢63纯合、杂合及农垦58S纯合这三种基因型单株数的比例符合1∶2∶1的单基因分离比。
　　2.在确定了pms1显隐性的基础上对6841个BC5F2群体单株用两端分子标记pj23和Fssr进行基因型分析，共得到88个重组单株。再利用新开发的11个分子标记进一步缩小定位区间。由于杂合基因型单株与农垦58S纯合基因型单株间育性的重叠，为了定位的可靠性，仅利用杂合基因型和明恢63纯合基因型发生交换的重组单株进行精细定位。最终将pms1定位于分子标记P4和P6之间4.0 kb的范围内，左右各1个重组单株，分子标记P5与pms1共分离。
　　3.将农垦58S中包含有该4.0 kb的基因序列互补转化到近等基因系NIL(MH)中，能降低受体长日照下的育性，短日照下无影响;反之，将对应来自于明恢63中的序列转化到农垦58S中没有表型的改变，说明该区域内确实包含有pms1的候选基因。
　　4.采用RACE的方法在定位区间内分离到一条全长cDNA，将此转录本命名为PMS1T。在长日照下抑制农垦58S中PMS1T的表达能够恢复育性，NIL(MH)中抑制PMS1T的表达对育性无影响;在NIL(MH)中超量表达PMS1T也能导致育性下降。这些结果都表明PMS1T就是控制光敏雄性不育的基因pms1。
　　5.对PMS1T表达谱分析发现PMS1T在与花粉发育相关的组织中表达量较高，在营养生长器官中表达量很低，并且在二次枝梗原基分化期、雌雄蕊形成期和花粉母细胞形成期的幼穗中优势表达，这三个时期也正是光敏感雄性不育的敏感时期。qPCR结果表明在这三个时期中长日照下农垦58S中PMS1T的表达量低于NIL(MH)及短日照下的农垦58S和NIL(MH)。
　　6.PMS1T在农垦58S和明恢63中的长度分别为1，453 bp和1，388bp，两者相差65bp。在PMS1T的5'端还存在两个SNP位点S1和S2，SNP S2和分子标记P5与pms1共分离。在多个水稻品种中对这几个序列差异进行比较测序表明SNP S2是造成光敏雄性不育的功能性突变。
　　7.PMS1T没有intron，位于基因间区，没有基因注释。预测有三个短的ORF，将农垦58S这三个预测ORF的起始密码子ATG后面插入碱基“G”，分别互补转化NIL(MH)，仍然能够正常发挥功能，降低NIL(MH)的育性，说明PMS1T不编码蛋白，是一个长链非编码RNA。
　　8.5' RLM-RACE和降解组测序数据证实了PMS1T能够被miR2118剪切。对长、短日照下农垦58S和NIL(MH)雌雄蕊形成期、花粉母细胞形成期和减数分裂期幼穗进行Small RNA-seq分析发现PMS1T能够从miR2118剪切位点开始形成18对21ntphasiRNA。这些PMS1T-phasiRNA的表达量在花粉母细胞形成期和减数分裂期幼穗中高于雌雄蕊形成期，其中4s phasiRNA和6s phasiRNA的量远高于其他phasiRNA。比较分析花粉母细胞形成期幼穗中的PMS1T-phasiRNA，在长日照下的农垦58S中表达量高于其他三种材料。同时发现PMS1T-phasiRNA的表达量与PMS1T转录本的表达量呈负相关。此外还分析了长日照花粉母细胞形成期幼穗中PMS1T-phasiRNA在转基因植株中的表达量。在超量表达农垦58SPMS1T转基因植株中，phasiRNA的表达量在阳性植株中高于阴性植株;与此相吻合的是，农垦58S PMS1T抑制表达的转基因阳性单株中phasiRNA的表达量低于阴性单株。这些结果表明PMS1T-phasiRNA与光敏雄性不育相关。转基因结果进一步证实失去了完整miR2118识别位点的农垦58S PMS1T不能发挥正常功能来降低NIL(MH)长日照下的育性，表明phasiRNA参与了光敏雄性不育的调控。PMS1T是到目前为止鉴定到的第一个具有生物学功能的PHAS基因，证明了这类小RNA对植物生长发育的重要性，同时也加深了我们对于光敏感雄性核不育机理的理解。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 植物雄性不育研究进展

1．2．1 细胞质雄性不育

1．2．2 细胞核雄性不育

1．2．3 水稻光温敏雄性核不育研究进展

1．3 Long non-coding RNA研究进展

1．3．1 Long non-coding RNA的定义，分类及功能

1．3．2 植物IncRNA研究进展

1．4 植物phasiRNA研究进展

1．4．1 tasiRNA的发现和形成过程

1．4．2 phasiRNA的形成和特异表达

1．5 研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 水稻材料及田间种植

2．2 定位群体的构建

2．3 分子标记的开发

2．4 转化载体及菌株

2．5 遗传转化载体构建及转化

2．5．1 互补载体构建

2．5．2 抑制载体构建

2．5．3 超表达载体构建

2．5．4 Target mimicry载体构建

2．5．5 农杆菌介导的遗传转化

2．6 水稻育性考察

2．7 水稻总DNA抽提

2．8 水稻材料基因型检测与转基因植株Southern blot拷贝数分析

2．9 水稻总RNA抽提

2．10 RACE与5’RLM-RACE

2．11 基因表达量分析与small RNA表达量分析

2．11．1 RT-PCR与qPCR

2．11．2 Stem-loop RT-PCR与page-northern blot

2．11．3 RPA(Ribonuclease Protection Assay)

2．12 Small RNA-seq及PARE文库构建

2．13 DNA甲基化分析

3 结果与分析

3．1 前人定位结果的验证

3．2 pms1显隐性关系的确定

3．3 pms1的精细定位

3．3．1 分子标记的获得

3．3．2 图位克隆pms1

3．4 pms1候选基因的分离和验证

3．4．1 互补转化结果

3．4．2 RACE确定pms1转录本

3．4．3 抑制PMS1T表达的转化结果

3．4．4 超量表达PMS1T的转化结果

3．5 PMS1T表达谱分析

3．6 PMS1T是一个long non-coding RNA

3．7 确定pms1的功能性序列差异

3．7．1 比较测序确定SNP S2是功能性序列差异

3．7．2 65 bp插入对光敏感雄性不育的影响

3．8 PMS1Y是PHAS基因

3．8．1 PMS1T是miR2118的靶基因

3．8．2 PMS1T产生phasiRNA

3．9 SNP S2与PMS1T-phasiRNA

3．9．1 SNP S2对miR2118介导的剪切效率的影响

3．9．2 PMS1T-phasiRNA可能的靶基因

3．10 PMS1T区间DNA甲基化分析

4 讨论

4．1 pms1的作用机理研究

4．2 未来研究方向

4．3 应用前景

4．4 Small peptide与IncRNA

4．5 phasiRNA与雄性不育

4．6 pms1与pms3间关系的讨论

参考文献

附录

在读期间研究成果

致谢