优良大豆根瘤菌株的分离、鉴定及应用研究

摘要

在种植豆科作物时施用根瘤菌接种剂，可以通过根瘤菌的生物固氮作用向作物提供氮素营养，从而促进作物增产，减少化学氮肥使用，保护土壤的生态环境。在我国的大豆种植中，根瘤菌接种剂的应用存在诸多问题，落后于发达国家。本论文针对优良大豆根瘤菌株的筛选、与大豆的品种匹配、田间应用等问题展开研究，以期为根瘤菌剂更好地应用于生产实践提供实验数据的支持。
　　本研究首先选取本实验室保存的6株快生型大豆根瘤菌和2株慢生型大豆根瘤菌USDA110、TA11，在砂培条件下，与我国不同地区的27个大豆主栽品种进行匹配实验。结果表明，6株快生型根瘤菌株能够与供试的24个大豆品种结瘤，其中HN01、GR3、HH29、HH103匹配性和固氮效率均不逊色于USDA110，具有在东北地区、黄淮海地区、长江流域、东南地区推广的潜能。从大豆品种看，中豆39、BD2、天隆1号接种8株根瘤菌后生物量都显著提高。根瘤菌与大豆品种的最佳匹配组合是GR3+中豆39、HN01+辽豆14、HN01+徐豆14和HN01+BD2，这些组合分别适合于长江流域、东北地区、黄海地区和东南地区。河北土壤盆栽实验结果表明，接种HN01的冀豆17的地上部分生物量和固氮酶活分别显著性(p＜0.05)提高40.8％和65.8％;在该土壤中的占瘤率达81.86％，具有较好的竞争结瘤能力。
　　其次进行了从土壤中分离、筛选优良土著根瘤菌的工作:利用黑龙江、河北和湖南等地的10个土壤样品，用结瘤法从中获得50多株大豆根瘤菌，再依据BTB反应确定了其中36株慢生型大豆根瘤菌。先后采用沙培、土培从中筛选出与黑龙江主栽大豆品种匹配性好的4株大豆根瘤菌。沙培结果表明:SN2-5、NW5-3、SN7-2、SN10-3都能与黑龙江17个主栽品种结有效瘤，其共生效应优于HN01和USDA110。土壤盆栽表明NW5-3、SN10-3、SN7-2与黑农61的匹配性良好。在10mM NH4NO3高氮处理下，4个供试菌与黑农61都能结瘤;与无氮条件相比，NW5-3和SN10-3形成的根瘤仍保留近50％的固氮酶活性，其中在高氮条件下SN10-3与黑农61的共生固氮匹配性最好。
　　在实验室研究的基础上，又进行了田间小区实验:用HN01和USDA110制备了草炭固体菌剂和浓缩液体菌剂。在河北省石家庄市、黑龙江省哈尔滨市的田间小区实验结果表明，在常规(100％)施肥条件下，加施固体菌剂使冀豆12、黑农61和龙哈10-4139产量分别提高11.33％、19.5％和7.1％;加施液体菌剂，冀豆12和冀豆17分别增产6.52％和8.27％。常规施肥减半(50％)条件下，配施根瘤菌固体菌剂使冀豆17增产4.68％。在不施常规肥的条件下，施固体菌剂，使龙哈10-4139增产20.3％;施液体菌剂，使冀豆17增产0.93％。两种复合菌剂能不同程度促进大豆结瘤、生长，提高大豆产量。
　　本研究还考察了根际促生细菌(PGPR) HZP1、HZK1与根瘤菌的混合接种效应。将PGPR菌与紫英云根瘤菌7653R混合接种土培的紫云英，结果显示，HZP1与7653R配合使用能显著性促进紫云英结瘤和提高植物的生物量，这说明HZP1具有潜在的应用价值。
　　上述工作初步探索了根瘤菌与大豆主栽品种、不同地区土壤间的匹配关系;初步探讨了3株PGPR的应用潜力;为将来的大面积田间实验和推广应用这些菌株提供实验依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 生物固氮对农业生产的意义

1．1．1 生物固氮概述

1．1．2 农作物生长的氮素来源

1．1．3 共生固氮在农业生产中的应用

1．2 根瘤菌接种剂在大豆种植中的应用

1．2．1 大豆根瘤菌剂在国外的应用现状

1．2．2 我国的根瘤菌资源与应用状况

1．3 影响根瘤菌剂功效发挥的因素

1．3．1 在田间条件下，豆科植物-根瘤菌的共生固氮过程

1．3．2 影响根瘤菌剂效能发挥的因素

1．4 提高根瘤菌接种剂效能的策略

1．4．1 筛选优良的根瘤菌菌株

1．4．2 建立合理的根瘤菌应用技术

1．5．本论文的研究目的、内容

1．6 技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试载体、质粒、菌株

2．1．2 供试大豆

2．1．3 供试土样和草炭

2．1．4 培养基

2．1．5 试剂

2．2 试验方法

2．2．1 分子生物学基本操作

2．2．2 从土样中分离土著根瘤菌

2．2．3 盆栽实验

2．2．4 大豆根瘤菌及PGPR的种属鉴定

2．2．6 根瘤固氮活性测定

2．2．7 田间试验

2．2．8 种子表面活菌数测定

2．2．9 MPN法测土壤中的土著根瘤菌

2．2．10 占瘤率测定

2．2．11 PGPR菌解磷能力测定

2．2．12 统计方法

3 结果与分析

3．1 本室保存的8株大豆根瘤菌与不同地区27个大豆品种的匹配性实验

3．2 大豆根瘤菌HN01和USDA110在土壤栽培大豆上的接种效应

3．3 大豆根瘤菌剂在黑龙江省哈尔滨市的田间实验

3．3．1 固体菌剂在黑农61上的接种效果

3．3．2 固体菌剂在龙哈10-4139上的接种效果

3．4 根瘤菌剂在河北省石家庄市的田间实验

3．4．1 根瘤菌剂在冀豆12上的接种效果

3．4．2 根瘤菌剂在冀豆17上的接种效果

3．5 优良土著大豆根瘤菌的分离鉴定和共生固氮效应考察

3．5．1 从10个土壤样品中分离土著根瘤菌

3．5．2 对36株慢生型大豆根瘤菌的初步筛选

3．5．3 对4株优良菌株的分类鉴定

3．5．4 优良根瘤菌株与黑龙江16个主栽大豆品种的共生匹配性检测

3．5．5 优良根瘤菌株在土壤栽培条件下的应用

3．5．6 优良根瘤菌株在高氮水平下的结瘤和固氮活性检测

3．6 紫云英根瘤菌与植物根际促生微生物(PGPR)的接种效应

3．6．1 几株PGPR的16S rDNA分子鉴定

3．6．2 几株PGPR的培养特性

3．6．3 HZP1菌株解磷能力的测定

3．6．4 紫云英根瘤菌与HZK1、HZP1细菌配合接种的盆栽试验

4 小结与讨论

4．1 小结

4．1．1 本室保存的8株大豆根瘤菌株与不同地区27个大豆主栽品种的匹配性研究

4．1．3 河北石家庄和黑龙江哈尔滨田间小区实验

4．1．4 从土壤中分离鉴定优良土著根瘤菌及接种效果研究

4．1．5 PGPR菌株的解磷能力及接种效应研究

4．2 讨论

参考文献

附录

致谢