大豆bHLH04G和bHLH06G转录因子的原核表达研究及对皂苷合成和结瘤固氮的影响

摘要

转录因子可以和启动子互作影响基因表达，对基因有重要的调控作用，bHLH家族转录因子是第二大转录因子。本实验围绕大豆中bHLH04G、bHLH06G两个转录因子对于皂苷合成和固氮结瘤的影响展开研究。β-香树脂醇合成酶是大豆皂苷合成的第一个关键酶，本团队窦富强同学用酵母单杂交筛选到与其互作的两个转录因子bHLH04G和bHLH06G。大豆是重要的油料作物，其代谢调控的研究对于改良大豆品质性状有着重要的意义。
　　本实验对这两个基因分别构建原核表达载体进行原核表达，发现这两个蛋白均主要形成包涵体，尝试不同的诱导条件并更换载体后，蛋白仍主要形成包涵体。此外，构建RNAi载体培养转基因大豆发根来研究这两个转录因子对于皂苷合成和固氮结瘤的影响。通过对转基因发根结瘤数统计和检测结瘤相关基因表达情况，发现将这两个基因分别沉默掉以后，结瘤数均显著减少，结瘤相关基因表达量均降低。同时检测转基因发根皂苷合成关键基因AMS表达情况并提取皂苷检测皂苷含量和成分的变化，发现将这两个基因沉默掉以后，AMS的表达量明显降低，皂苷元B、C和E的相对含量也有所降低。因此推测这两个转录因子对大豆皂苷合成和结瘤固氮具有正向调控作用。
　　为进一步明确这两个转录因子对大豆皂苷合成和结瘤固氮的调控机理，构建RNAi-AMS载体培养转基因发根。通过对转基因发根结瘤数统计并检测结瘤相关基因表达情况，发现将AMS沉默掉以后，结瘤数减少，结瘤相关基因的表达量降低。因此推测AMS也对大豆结瘤固氮有正向调控作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1．2 bHLH转录因子的发现和结构特点

1．1．3 bHLH转录因子的生物学功能

1．2 大豆三萜皂苷研究进展

1．2．1 大豆三萜皂苷的构成和功能

1．2．2 大豆三萜皂苷的生物合成

1．2．3 大豆三萜皂苷合成的关键酶

1．3 大豆与根瘤菌的共生固氮系统

1．3．1 共生固氮的意义

1．3．2 根瘤的形成过程

1．3．3 结瘤信号传导途径

1．4 本研究选题依据、目的意义和技术路线

1．4．1 选题依据

1．4．2 目的意义

1．4．3 技术路线

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体、菌株

2．1．3 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 植物材料总RNA提取

2．2．2 RNA反转录为cDNA

2．2．4 PCR产物切胶回收

2．2．6 大肠杆菌DH5α感受态的制备(CaCl2法)和热激转化制备感受态

2．2．7 质粒提取

2．2．9 bHLH04G、bHLH06G基因在大肠杆菌Transetta中诱导表达

2．2．10 原核表达所需溶液配方

2．2．11 检测蛋白的可溶性

2．2．12 bHLH04G、bHLH06G过表达和RNAi载体的构建

2．2．13 农杆菌电击转化感受态细胞的制备

2．2．14 农杆菌电击转化

2．2．15 大豆发根转化

2．2．16 荧光定量PCR

2．2．17 大豆皂苷提取

3 结果与分析

3．1 bHLH04G蛋白性质分析

3．2 bHLH06G蛋白性质分析

3．3 pET28a(+)-bHLH04G、pET28a(+)-bHLH06G载体的构建

3．4 pET28a(+)-bHLH04G、pET28a(+)-bHLH06G的原核表达

3．5 pET28a(+)-bHLH04G、pET28a(+)-bHLH06G的可溶性蛋白检测

3．6 pGEX4T1-bHLH04G、pGEX4T1-bHLH06G载体的构建和原核表达

3．7 pGEX4T1-bHLH04G、pGEX4T1-bHLH06G的可溶性蛋白检测

3．8 RNAi载体的构建

3．9 大豆发根中bHLH04G沉默对结瘤固氮的影响

3．10 大豆发根中bHLH06G沉默对结瘤固氮的影响

3．11 大豆发根中bHLH04G沉默对皂苷合成的影响

3．12 大豆发根中bHLH06G沉默对皂苷生物合成的影响

3．13 大豆发根中AMS沉默对结瘤固氮的影响

4 讨论

参考文献

附录

致谢