油菜细胞壁机械特性、激素与活性氧信号响应低硼胁迫的基因型差异

摘要

甘蓝型油菜（Brassica napusL.）对低硼胁迫非常敏感，缺硼导致油菜籽粒产量严重下降。我国油菜主产区的土壤普遍缺硼，虽然增施硼肥可以缓解油菜缺硼，但是硼矿属于不可再生资源，且施肥不当易造成作物硼中毒现象。因此，筛选甘蓝型油菜硼高效种质资源、揭示硼高效的生理与分子机制，对于油菜的优质高产具有重要的理论与实践意义。课题组前期已筛选获得甘蓝型油菜硼高效和硼低效种质，并在此基础上开展了硼高效生理机制和遗传基础方面的研究。但是硼高效的机制非常复杂，不仅涉及硼的吸收、转运和分配，而且还涉及激素代谢、活性氧与钙信号的调控，甚至还存在植株细胞、组织和器官之间的相互作用等。本研究以甘蓝型油菜硼高效基因型‘QY10’和硼低效基因型‘W10’的下胚轴为外植体建立了悬浮细胞体系，同时结合油菜植株体，利用各种现代物理、化学、分子生物学研究手段及显微观察技术，从植物激素、细胞壁果胶、活性氧与钙信号等方面系统研究了硼高效的机制，主要获得如下结果:
　　1甘蓝型油菜悬浮细胞体系的建立及响应低硼胁迫的基因型差异
　　以甘蓝型油菜基因型‘QY10’和‘W10’的下胚轴为外植体，建立了油菜悬浮细胞的培养技术，研究了油菜悬浮细胞对低硼胁迫的响应和基因型间的差异。随着介质硼浓度的减小，细胞活性显著降低，畸形细胞数目明显增多。在0.1μM和0.25μM硼浓度下，‘W10’的悬浮细胞数量与活性均显著低于‘QY10’，说明油菜硼效率的高低在单细胞水平即存在显著的基因型差异。该体系不仅适用于甘蓝型油菜硼效率的鉴定，也可以作为单细胞水平下研究甘蓝型油菜的一种手段。
　　2果胶介导的细胞壁力学性能的差异赋予了油菜基因型不同的低硼敏感性
　　利用扫描与透射电子显微镜观察发现缺硼时‘W10’悬浮细胞细胞壁加厚，易破裂。进一步利用原子力显微镜检测发现缺硼时‘W10’细胞壁力学性能显著弱于‘QY10’，然而两基因型在正常硼或者缺硼条件下去除果胶，细胞壁力学性能的差异消失，说明果胶是导致‘QY10’和‘W10’低硼敏感性不同的重要因素。随后我们发现‘W10’的果胶浓度显著高于‘QY10’，而且缺硼时‘W10’细胞壁上存在更高比例的RG-Ⅱ单体，从而导致细胞壁结构不稳定。通过数字基因表达谱与定量PCR验证，均发现‘W10’果胶合成相关基因的表达量显著高于‘QY10’。通过分析油菜自然群体中硼高效与硼低效基因型的果胶浓度及其RG-Ⅱ单体（mRG-Ⅱ）与二聚体(dRG-Ⅱ)比例，证实了细胞水平上的研究结果，说明油菜细胞壁较低的果胶浓度更有利于植株抵抗低硼胁迫。
　　3油菜植物激素及相关基因响应低硼胁迫的时空模式
　　数字基因表达谱结果显示，低硼下不同硼效率基因型间激素相关基因的表达存在显著差异。我们重点研究了生长素、茉莉酸和脱落酸对低硼胁迫的分子响应，长期低硼胁迫降低了生长素的浓度及其合成与输出基因的表达，增加了茉莉酸和脱落酸的浓度，诱导了脱落酸合成与受体基因的表达。低硼胁迫下，硼低效材料‘W10’茎尖与根中的生长素浓度和输出基因的表达量均显著下降，它们可能分别促进了侧枝萌发和抑制了根系生长。进而我们发现外源添加生长素可以显著缓解‘W10’的缺硼症状。上述结果说明缺硼时生长素代谢的紊乱是导致植株出现生理缺陷及基因型差异的重要因素。
　　4活性氧和钙离子信号参与油菜不同基因型对低硼胁迫的差异反应
　　低硼胁迫下，活性氧在根尖累积部位与根中细胞大量死亡的区域一致。低硼胁迫下，无论是植株根系还是悬浮细胞，‘W10’超氧阴离子增加的幅度均显著高于‘QY10’，添加外源超氧阴离子清除剂能显著缓解细胞死亡。过氧化氢变化趋势与超氧阴离子类似，但是没有超氧阴离子变化剧烈，外源过氧化氢清除剂对缓解细胞死亡效果不显著。缺硼导致‘W10’细胞质膜稳定性降低，同时造成严重的离子渗漏，包括钾离子外流。低硼胁迫诱导钙离子内流，利用钙离子通道抑制剂预处理根系发现活性氧累积减少，说明钙离子信号在活性氧的上游发挥作用。通过测定编码活性氧产生酶基因的表达与抗氧化酶的活性，发现低硼胁迫时基因型间活性氧积累的差异取决于活性氧的产生，而非活性氧的清除能力。

目录

论文说明

声明

摘要

1 文献综述

1．1 植物硼营养概述

1．1．1 硼的生理功能

1．1．2 土壤与植物体硼的浓度和分布

1．1．3 植物的缺硼症状

1．1．4 植物硼高效的生理与分子机制

1．2 硼对植物细胞壁结构和力学性能的影响

1．3 低硼胁迫对植物激素信号的影响

1．3．1 低硼胁迫对生长素的影响

1．3．2 低硼胁迫对其它植物激素的影响

1．4 低硼胁迫对植物活性氧信号的影响

1．5 植物钙、活性氧、激素信号的互作

1．5．1 钙与活性氧的互作

1．5．2 激素与活性氧的互作

1．5．3 激素与钙的互作

1．6 植物细胞培养研究进展

2 课题研究的背景、内容和技术路线

2．1 研究背景

2．2 研究内容

2．3 技术路线

3 果胶介导的细胞壁机械特性与甘蓝型油菜低硼敏感性的关系

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 悬浮细胞体系的建立

3．2．3 材料培养及硼浓度处理

3．2．4 细胞活性的测定

3．2．5 细胞超微结构的观察

3．2．6 细胞壁的提取与分级

3．2．7 原子力显微镜(AFM)测定细胞表面形貌及力学性能

3．2．8 根系扫描与根系细胞壁弱化的检测

3．2．9 原生质体培养与细胞壁再生能力的鉴定

3．2．10 果胶的提取与细胞壁组分中糖醛酸含量的测定

3．2．13 高通量数字基因表达谱测序

3．2．14 总RNA的提取及逆转录

3．2．15 基因引物设计及实时定量表达(qRT-PCR)分析

3．2．16 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 硼对油菜悬浮细胞生长的影响

3．3．2 硼对油菜悬浮细胞显微形态的影响

3．3．3 硼对油菜细胞壁力学性能的影响

3．3．4 硼对油菜原生质体细胞壁再生的影响

3．3．5 硼对果胶浓度及RG-Ⅱ单体与二聚体比例的影响

3．3．6 硼高效和硼低效基因型果胶合成相关基因表达的差异

3．3．7 油菜果胶含量的自然变异

3．4 讨论

3．4．1 低硼导致细胞壁力学性能的弱化促使细胞破裂

3．4．2 细胞壁果胶含量的差异与基因型间缺硼敏感性的关系

3．4．3 果胶RG-Ⅱ的二聚化程度与细胞壁的力学性能

3．4．4 果胶响应低硼胁迫与调控细胞壁强度的模型

4 甘蓝型油菜硼高效和硼低效基因型响应低硼胁迫的激素变化

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 材料培养及硼处理

4．2．3 根系扫描，生物量与硼浓度的测定

4．2．4 高通量数字基因表达谱测序

4．2．5 生长素、茉莉酸、脱落酸及相关前体物质或者衍生物的提取和测定

4．2．6 总RNA的提取及逆转录

4．2．8 显微观察分析

4．2．9 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．2 激素相关基因响应低硼胁迫时的数字基因表达谱分析

4．3．3 硼对生长素浓度及相关基因表达的影响

4．3．4 拟南芥生长素相关转基因材料对低硼的响应

4．3．5 低硼胁迫下外源添加生长素对甘蓝型油菜生长的影响

4．3．6 硼对茉莉酸浓度及相关基因表达的影响

4．3．7 硼对脱落酸浓度及相关基因表达的影响

4．4 讨论

4．4．1 低硼胁迫降低生长素的浓度从而影响腋芽与根系的生长

4．4．2 荣莉酸对低硼胁迫的响应

4．4．3 脱落酸对低硼胁迫的响应

5 活性氧与钙离子参与低硼诱导的细胞死亡

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 材料培养及硼处理

5．2．3 细胞活性的测定

5．2．4 根系扫描与硼浓度的测定

5．2．5 离子渗漏的测定

5．2．6 组织化学染色

5．2．7 MDA，O2-和H2O2浓度测定

5．2．11 K+和Ca2+流的测定

5．2．12 抗氧化酶活性的测定

5．2．13 活性氧清除剂以及钙离子通道抑制剂的前处理

5．2．14 数据分析

5．3 结果与分析

5．3．1 硼对植株根系生长及细胞活性的影响

5．3．2 低硼胁迫下基因型间硼浓度及硼吸收相关基因的表达

5．3．3 硼对主根质膜稳定性的影响

5．3．4 低硼胁迫诱导活性氧爆发及相关基因的表达

5．3．5 低硼胁迫引起的离子流变化

5．3．6 钙离子作用于ROS的上游

5．3．7 低硼胁迫对抗氧化酶活性的影响

5．3．8 超氧阴离子特异清除剂缓解缺硼时根系和悬浮细胞的细胞死亡

5．4 讨论

6 全文总结与展望

6．1 研究总结

6．2 本研究主要创新点

6．3 本研究不足之处

6．4 研究展望

参考文献

致谢

作者简介