陆地棉GhNAC3在棉花响应非生物逆境中的功能研究

摘要

非生物逆境胁迫严重影响棉花的生长发育、产量及纤维品质，培育抗逆的棉花新品种对棉花生产具有重要的意义。NAC(NAM，ATAF1/2，CUC2)是植物特有的一类转录因子，广泛参与植物对非生物逆境的响应。本研究基于前期棉花干旱胁迫表达谱分离到一个显著诱导表达的NAC基因GhNAC3，对其在棉花中参与响应干旱和盐胁迫的功能进行初步鉴定和机制探索，主要结果如下:
　　我们在棉花中鉴定到232个NAC家族转录因子，并基于公共数据库表达谱数据对其组织表达模式和逆境诱导表达模式进行了分析。同时，我们从陆地棉中克隆到GhNAC3基因，氨基酸序列多重比对结果显示该基因具有保守的NAC结构域;亚细胞定位实验表明GhNAC3编码一个核定位蛋白;酵母反式激活实验揭示GhNAC3 BD结构域(1-160aa)不具有转录激活能力，AD结构域(161-298aa)具有转录激活能力。组织表达模式分析发现GhNAC3在根和花中优势表达;非生物逆境表达模式分析表明，GhNAC3受PEG和NaCl诱导显著上调表达。另外，对GhNAC3启动子的cis-element分析，发现该基因的启动子区域具有响应干旱、盐和ABA的一些顺式作用元件，如 ERD1(early responsive to dehydration)、 DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat)等。
　　在拟南芥中超表达GhNAC3，萌发实验及根长实验表明超表达该基因可以增强转基因拟南芥对渗透压胁迫和盐胁迫的耐受性，对ABA的敏感性降低。利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS)沉默GhNAC3的表达，ABA含量在干涉材料中显著降低;干旱处理后，在干涉材料中积累较多的过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA);离体叶片失水处理、自然干旱和叶盘实验表明在棉花中沉默该基因可以降低棉花对干旱和盐胁迫的耐受性。通过农杆菌侵染棉花下胚轴转化技术，我们获得了稳定转化的超表达材料，与阴性分离材料和野生型一起进行PEG6000模拟的渗透胁迫实验，结果表明，超表达材料较对照材料表现出更好的生长势。
　　以上结果表明，GhNAC3是一个参与调控棉花响应非生物逆境的基因，我们推测该基因可能通过介导ABA信号参与棉花响应干旱和盐胁迫。本研究棉花抗逆育种提供基因资源和理论基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 NAC转录因子的发现

1．3 NAC转录因子的调控机制

1．4 NAC转录因子的生物学功能

1．4．1 NAC转录因子与植物生长发育

1．4．2 NAC转录因子与植物逆境胁迫

1．5 棉花中NAC转录因子的研究进展

1．6 本研究的目的和意义

1．7 技术路线

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 基因来源

2．1．2 植物材料

2．1．3 主要菌株和载体

2．2 实验方法

2．2．1 陆地棉NAC转录因子家族生物信息分析

2．2．2 GhNAC3序列及其启动子序列分析

2．2．3 载体构建

2．2．4 亚细胞定位

2．2．5 反式激活

2．2．6 病毒诱导基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)

2．2．7 GhNAC3异源表达拟南芥的遗传转化、阳性植株和纯系筛选

2．2．8 GhNAC3棉花转基因材料的获得及阳性检测

2．2．9 棉花总RNA提取与cDNA反转录

2．2．10 Southern Blotting

2．2．11 干旱和盐胁迫表型鉴定

2．2．12 生理指标的测定

3 结果与分析

3．1 陆地棉NAC转录因子基因家族分析

3．2 GhNAC3的克隆和聚类分析

3．3 GhNAC3组织表达模式及逆境表达模式分析

3．4 GhNAC3蛋白的亚细胞定位

3．5 GhNAC3反式激活试验

3．6 GhNAC3启动子序列分析

3．7 拟南芥中异源超表达GhNAC3基因后抗逆性鉴定

3．7．1 萌发期，异源超表达GhNAC3的拟南芥耐盐性抗渗透压能力增强，对激素ABA的敏感性降低

3．7．2 幼苗期，根长实验验证异源超表达GhNAC3的拟南芥抗渗透压能力增强

3．8 利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术在棉花中沉默GhNAC3基因鉴定对非生物逆境的抗性

3．8．1 VIGS-GhNAC3增强棉花植株对干旱的敏感性

3．8．2 VIGS-GhNAC3增强棉花植株对盐的敏感性

3．9 GhNAC3稳定转化棉花材料的分子鉴定

3．9．1 GhNAC3转基因株系表达量分析结果

3．9．2 GhNAC3转基因株系拷贝数分析

3．9．3 GhNAC3转基因植株抗旱性鉴定

4 讨论

4．1 棉花中NAC转录因子广泛响应逆境胁迫

4．2 GhNAC3可能通过调节ABA含量参与对逆境的响应

参考文献

附录

致谢