杜洛克×二花脸F2资源群体免疫相关性状全基因组关联分析及候选基因功能初步研究

摘要

现代商业猪种经过长期高强度选择而使得抗病力严重下降是导致养猪生产实践中猪病频发的重要原因之一，从遗传源头提高猪的抗病性能已被学界公认为是猪病综合防控链中的根本性环节之一。近年来逐渐成熟的分子育种技术从理论上为猪抗病力的有效改良提供了契机，但有效开展猪抗病力的分子育种，需要以充分理解猪抗病力性状的分子遗传基础为前提。与猪抗病力直接或间接相关的性状有很多，其中因样品采集的方便性，血液免疫性状（指标）是监测机体免疫性能的重要指示性状，外周血为解析猪抗病力性状的遗传调控机理提供了重要窗口，深入解析猪血液免疫性状的遗传基础有助于准确理解猪抗病力的分子调控机制，并为猪抗病力的分子育种提供有效的基因素材。
　　鉴于此，本研究针对猪外周血免疫性状的遗传解析这一研究主题，利用杜洛克×二花脸猪F2群体，结合Illumina公司猪60K SNP芯片分型数据，以血液五分类指标、T淋巴细胞亚群、细胞因子、免疫球蛋白G、抗体水平等性状作为主要研究对象，运用单标记全基因组关联分析与单倍型全基因组关联分析两种全基因组遗传解析策略，从基因组水平系统解析猪外周血免疫性状的遗传结构(genetic architecture)，在此基础上挖掘猪抗病力的重要候选基因，并开展候选基因功能的初步研究。本研究在一定程度上推进了猪抗病力分子遗传基础的认识，同时也为猪抗病力的分子育种提供了基因素材，故本研究有较重要的学术意义。本研究取得的主要研究结果如下:
　　1.使用PLINK软件，对基因分型个体进行初步质控，去除了1头因基因判型率小于90％的F2代个体;剔除了2，613个由于call rate值低于90％的SNP;剔除了10，907个由于MAF＜0.01的SNP;排除了1，330个由于显著偏离哈代-温伯格平衡（P值＜10-5）的SNP。此外，未被确定染色体物理位置的SNP也被排除在后续的分析之外，最后得到43，481个SNP用于GWAS分析。
　　2.在R软件中编写了一个脚本计算个体的最佳匹配父母本，对F2代家系进行亲缘关系校正，发现了10个个体存在错误，主要为:1）个体重复判型;2）个体编号位置调换;3）系谱信息记录错误;4）同一窝出生仔猪中存在偷配（盗配）;5）SNP芯片判型个体中混入未参与群体构建的个体，后对这些错误一一做出纠正。
　　3.采用GenABEL软件包进行单标记全基因组关联分析，得到如下结果:
　　(1)鉴定了138个与31个血液参数显著关联的SNP，其中包括23个基因组显著水平SNP和116个建议显著水平SNP，这些显著SNP分布在除8号、11号、15号、16号染色体以外的其他染色体上。在4个不同时间点中，嗜中性粒细胞百分比(NER)和血小板分布宽度(PDW)这两个性状没有检测到显著关联的SNP;
　　(2)鉴定了2，252个与15个T淋巴细胞亚群显著关联的SNP，主要分布在5号染色体和3染色体上;
　　(3)鉴定了15个与7个细胞因子性状显著关联的SNP，主要分布在1号、2号、10号、14号以及15号染色体上;
　　(4)没有检测到与体温、体重显著关联的SNP。
　　4.利用单倍型（连锁不平衡-连锁平衡分析）分析，得到如下结果:
　　(1)鉴定了573个与6个不同血液参数显著关联的SNP，其中MCHC33达到基因组显著水平，鉴定到的显著SNP主要分布于6号、7号以及8号染色体上;
　　(2)鉴定了18，533个与15个不同T淋巴细胞亚群显著关联的SNP，主要分布于5号和3号染色体;
　　(3)未检测到与细胞因子、免疫球蛋白水平、体温、体重显著关联的SNP。
　　5.挑选了与CD3+CD4+ T％35性状相关的14个候选基因进行组织表达谱分析，发现CD4、ZNF384、 VAMP1、TAPBPL、CD27、TNFRSF1A、CD9、VWF等8个基因在血液中有表达，对这8个基因进行定量PCR验证发现CD4基因的表达量在表型值极端个体组间未呈现出差异，而在表型值高组中TNFRSF1A、CD9、VWF基因的表达量均显著高于表型值低组，其他基因在表型值高低组间亦没有差异。
　　6.对CD4全长CDS进行克隆、测序，在F2代个体中发现两种单倍型，CD3+CD4+T％35表型值高的个体单倍型为GG，表型值低的个体单倍型为AA，比对两种单倍型的碱基序列和氨基酸序列后发现其主要差异位于3号外显子高变区中，为确定3号外显子高变区11个SNP是否完全连锁，在中国地方猪种、西方商业猪种、欧洲野猪、东南亚野猪中直接对CD4高变区3号外显子进行单克隆测序后发现该外显子中存在另外3个SNP，其与已发现的11个SNP不完全连锁，共发现10种单倍型，由测序数据可知，如果不考虑新发现的3个SNP，那么剩下的11个SNP就是完全连锁的，为此我们开发了一个分子标记用于识别两种不同的单倍型。而后调取公共数据库中的重测序数据，发现在中国地方猪种中广泛存在单倍型A，而在西方商业猪种或欧洲本地猪种中几乎没有多态且主要为单倍型G。对检测到的10种单倍型进行分子进化树的构建，发现单倍型A和单倍型G可明显分为两个枝节，这暗示CD4分子不同的进化起源。
　　7.挑选与CD8+ T％20性状相关的4个候选基因，NCK2、NCK1、FHL2、AFF3，对其进行定量PCR验证，发现这几个基因在CD8+ T％20表型值高低组间mRNA水平表达不差异;挑选与CD3-CD8-T％33性状相关的1个候选基因LRR TM4进行定量PCR验证，发现在表型值高低组间表达也不差异。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 猪抗病育种候选基因的研究进展

1．2．2 常见畜禽免疫性状全基因关联分析研究进展

1．2．3 猪免疫和抗病性相关QTL

1．2．4 猪免疫相关性状GWAS研究进展与不足

1．2．5 本研究中涉及的重要候选基因的研究进展

1．3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验样品

2．1．3 所用载体

2．1．4 主要试剂与试剂盒

2．1．5 常用试剂及配制

2．1．6 主要仪器和设备

2．1．7 主要用到的软件、网站和数据库

2．2 方法

2．2．1 本研究的技术路线

2．2．2 试验材料的采集

2．2．3 免疫相关表型的测定及预处理

2．2．4 基因组DNA的提取

2．2．5 猪血液或组织样总RNA的提取及cDNA的合成

2．2．6 猪全基因组60K SNP芯片的分型

2．2．7 基因分型结果初步质控

2．2．8 资源家系的血缘鉴定

2．2．9 全基因组关联分析

2．2．10 性状表型值的遗传力估计

2．2．12 候选基因的定量表达分析

2．2．13 猪CD4基因的序列克隆、测序分析

2．2．14 CD4基因高变区进化树的构建

2．2．15 GO分析与通路分析

3 结果与分析

3．1 猪基因组DNA与RNA的提取与质量检测

3．2 资源群体免疫相关性状描述性统计结果

3．3 质控后的SNP分布

3．4 资源家系亲缘关系的校正

3．5 全基因组关联分析结果

3．5．1 单标记全基因组关联分析结果

3．5．2 单倍型全基因组关联分析结果

3．6 猪免疫相关性状的遗传力估计

3．7 与CD3+CD4+／CD3+CD4-T淋巴细胞亚群相关候选基因实验结果

3．8 CD4高变区在不同种群中的进化分析

3．9 CD4高变区两种主要单倍型在中外、家野猪中的分布

3．10 与CD8+／CD8-T％20淋巴细胞亚群相关的候选基因定量PCR结果

3．11 与CD3-CD8-T％33淋巴细胞亚群相关的候选基因定量PCR结果

3．12 GO分析与KEGG通路分析

4 讨论

4．1 关于提取高质量猪基因组DNA的讨论

4．2 关于系谱记录、表型测定、DNA提取和SNP分型系列过程的讨论

4．3 关于全基因组关联分析的讨论

4．3．1 关于不同的统计方法得出的结果的比较

4．3．2 关于全基因组关联分析的结果

4．3．3 与前期GWAS结果的比较

4．4 关于CD4基因两种单倍型在不同种群中分布及实际生产中的应用

4．5 关于可能影响CD8+T细胞亚群增殖的讨论

5 小结

5．1 主要研究结果与结论

5．2 本研究的创新点与特色

5．3 本研究的不足之处与值得进一步研究的问题

参考文献

在读期间其他工作

附录

攻读学位期间撰写论文题录

致谢