大白猪CXCL8的克隆表达及生物学活性研究

摘要

CXCL8是一种CXC趋化因子，可激活和趋化中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等。中性粒细胞可向感染处聚集并参与炎症反应，该反应受CXCL8的调节，迅速、强烈，是宿主防御的第一道防线。但是，炎症过程中过量的中性粒细胞浸润也会导致过度炎症反应，导致宿主组织细胞被破坏。在大部分猪病发生发展过程中，炎症是最主要的病理变化，而CXCL8在这些疾病过程中也起重要的作用。大白猪是我国养猪业重要的猪种之一，目前对大白猪CXCL8的研究报道比较少。本研究克隆了大白猪CXCL8基因，对CXCL8及CXCL8的突变体(G58P)进行可溶性表达，并验证了它们的生物学活性，为进一步研究猪CXCL8的功能与作用机制，开发抑制猪炎症的靶向性药物提供了基础。主要研究内容如下:
　　1.大白猪CXCL8及G58P的克隆与表达纯化
　　提取大白猪肺组织mRNA，利用RT-PCR扩增CXCL8基因。测序正确后将该基因克隆至pGEX-6p-1载体上，获得重组质粒pGEX-PCXCL8。转化至大肠杆菌Rosetta中，经表达条件的优化，外源基因在上清中高效表达。通过蛋白纯化系统AKTA prime10纯化目的蛋白，SDS-PAGE及Western Blot显示蛋白纯化效果较好。将CXCL8第58位甘氨酸(G)突变为脯氨酸(P)，根据相应的碱基序列合成CXCL8突变体基因G58P，利用DNA重组技术将其克隆至pGEX-6p-1载体上，按照上述方法表达纯化G58P蛋白。
　　2.CXCL8的体内活性验证
　　将重组蛋白用生理盐水稀释到4mg/mL、400μg/mL、40μg/mL、4μg/mL，分别以25μL不同浓度的PCXCL8重组蛋白对BALB/c小鼠进行滴鼻，同时设置相同浓度的GST蛋白对照组及生理盐水空白对照组。12h后剖杀所有小鼠，取肺进行组织病理学观察，BALF中性粒细胞计数，肺组织MPO活力检测来评估重组蛋白的生物学活性。组织病理学观察发现不同浓度的PCXCL均可引起小鼠肺炎，4mg/mL GST组有轻微的炎症，其余浓度GST组与生理盐水对照组没有明显异常;PCXCL8实验组MPO活力均显著高于GST对照组及生理盐水组;4mg/mL PCXCL8滴鼻组BALF中性粒细胞数目远远高于GST组。
　　3.G58P的体内活性验证
　　实验组以4mg/mL浓度G58P25μL剂量滴鼻处理BALB/c小鼠，同时设置PCXCL8阳性对照组，PCXCL8与G58P混合组，生理盐水对照组，不作处理的空白对照组。12h后剖杀所有小鼠，取肺脏。通过组织病理学观察，BALF中性粒细胞计数，肺组织MPO活力检测来评估G58P的生物学活性。组织病理学观察发现实验组、混合组、PCXCL8对照组均呈现肺炎特征，生理盐水对照组与空白对照组没有明显异常;实验组、混合组、PCXCL8对照组MPO活力无显著差异，但均显著高于生理盐水对照组和空白对照组;实验组、混合组、PCXCL8对照组BALF中性粒细胞数目无显著差异，但均显著高于生理盐水对照组和空白对照组。
　　结论:利用原核表达载体pGEX-6p-1，可以对PCXCL8与G58P进行可溶性表达，所获得PCXCL8与G58P蛋白都具有良好的生物学活性;PCXCL8第58位氨基酸G-P突变不能对其生物学活性产生重要影响。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 CXCL8基因的结构

1．2 CXCL8蛋白的结构

1．3 CXCL8的来源

1．4 CXCL8的生物活性

1．5 CXCL8的受体

1．6 CXCL8与疾病的关系

1．7 CXCR1／2的拮抗剂

1．8 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 质粒与菌株

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要试剂配制

2．2 试验方法

2．2．1 大白猪CXCL8基因的克隆与测序分析

2．2．2 大白猪PCXCL8的生物信息学分析

2．2．3 大白猪PCXCL8原核表达载体的构建

2．2．4 重组蛋白的表达纯化

2．2．5 GST蛋白的原核表达与纯化

2．2．6 重组蛋白pGEX-PCXCL8体内活性实验

2．2．7 突变蛋白G58P的制备

2．2．8 G58P对大白猪CXCL8体内活性影响的初步探究

3 结果

3．1 大白猪CXCL8基因的克隆与序列分析

3．1．1 PCR扩增目的基因

3．1．2 菌液PCR鉴定

3．1．3 测序结果的比对及分析

3．2 CXCL8的生物信息学分析

3．2．1 蛋白信号肽的预测

3．2．2 蛋白跨膜结构的预测

3．3 大白猪CXCL8蛋白的原核表达与纯化

3．3．1 大白猪CXCL8原核表达载体的构建

3．2 pGEX-PCXCL8重组蛋白的预表达

3．3．3 pGEX-PCXCL8重组蛋白的大量表达和纯化

3．3．4 pGEX-PCXCL8重组蛋白的Western-Blot鉴定

3．4 GST蛋白的原核表达与纯化

3．5 重组蛋白pGEX-PCXCL8体内活性实验

3．5．1 髓过氧化物酶分析

3．5．2 支气管肺泡冲洗液(BALF)中性粒细胞计数

3．5．3 组织病理学观察

3．6 G58P对大白猪CXCL8活性影响的初步探究

3．6．1 突变蛋白G58P的制备

3．6．2 髓过氧化物酶分析

3．6．3 支气管肺泡冲洗液(BALF)中性粒细胞计数

3．6．4 组织病理学观察

4 讨论

4．2 CXCL8的可溶性表达与蛋白纯化

4．3 重组蛋白pGEX-PCXCL8体内活性试验分析

4．4 G58P对大白猪CXCL8活性影响的初步探究

5 结论

参考文献

致谢